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        發(fā)光二極管熒光顯微鏡在基層應(yīng)用的多中心研究

        2011-09-20 09:58:42夏輝趙冰李強(qiáng)歐喜超王勝芬趙雁林
        中國(guó)防癆雜志 2011年9期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)室

        夏輝 趙冰 李強(qiáng) 歐喜超 王勝芬 趙雁林

        痰涂片顯微鏡檢查在結(jié)核病防治工作中對(duì)于發(fā)現(xiàn)傳染源、診斷、療效評(píng)價(jià)等具有重要作用。目前我國(guó)大部分地區(qū)使用萋尼染色法(簡(jiǎn)稱Z-N法),其成本低廉、特異度較高,但靈敏度較低。熒光染色方法靈敏度較Z-N法能夠提高約10%,且特異度與之相當(dāng)[1]。然而,普通汞蒸汽燈泡熒光顯微鏡成本高、燈泡使用壽命短(200~300h左右)、需要專門的暗室等限制了其推廣使用。發(fā)光二極管在熒光顯微鏡中的使用降低了熒光顯微鏡的成本。盡管國(guó)內(nèi)外有一些關(guān)于熒光染色發(fā)光二極管熒光顯微鏡(簡(jiǎn)稱LED)檢測(cè)方法的研究,但其在我國(guó)縣(區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的可靠性、可行性等尚沒有進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估。本研究對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市賽罕區(qū)和林格爾縣,江蘇省淮安市淮陰區(qū)、楚州區(qū),湖南省長(zhǎng)沙市寧鄉(xiāng)縣、常德市桃源縣等6個(gè)縣(區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室LED的使用情況進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估,為L(zhǎng)ED在中國(guó)基層推廣使用提供實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

        材料和方法

        1.研究對(duì)象:收集2009年12月至2010年6月間6個(gè)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡(jiǎn)稱結(jié)防機(jī)構(gòu))就診的初診肺結(jié)核可疑癥狀者及正接受治療的隨訪肺結(jié)核患者,共納入6208例(痰標(biāo)本11288份),其中3691例為初診可疑癥狀者(6809份痰標(biāo)本),2509例為隨訪患者(痰標(biāo)本4467份),8例(12份標(biāo)本)沒有記錄初診或隨訪。初診可疑癥狀者中29.78%(1099/3691)收 集 3 份 痰 標(biāo) 本,46.79%(1727/3691)的患者僅收集1份痰標(biāo)本,其余患者收集2份痰標(biāo)本;隨訪患者中79.71%(2000/2509)收集2份痰,20.01%(502/2509)收集1份痰標(biāo)本,極少數(shù)患者收集3份或以上份痰標(biāo)本。

        2.試驗(yàn)方法:每份痰標(biāo)本制作2張涂片,分別由2名實(shí)驗(yàn)室人員用Z-N和LED法進(jìn)行染色和鏡檢,鏡檢過程嚴(yán)格質(zhì)量控制。

        Z-N法染色采用石碳酸復(fù)紅熱染5min,LED法采用金胺O冷染15~20min。Z-N法使用1000×鏡觀察(100×物鏡、10×目鏡),LED法在400×鏡下觀察(40×物鏡、10×目鏡),具體染色方法及報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[2] 。

        3.試劑和材料:Z-N和LED法采用試劑均為商品化試劑(珠海貝索生物技術(shù)有限公司,Z-N試劑批號(hào)為410021和410042,熒光試劑批號(hào)為410021和410051)。發(fā)光二極管熒光顯微鏡為Primo star發(fā)光二極管熒光顯微鏡(蔡司公司)。

        4.統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)統(tǒng)一錄入Epidata數(shù)據(jù)庫(kù),用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析。兩率之間的比較采用卡方檢驗(yàn),兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        5.質(zhì)量控制:所有參與研究的人員均接受了統(tǒng)一培訓(xùn),并進(jìn)行熟練度測(cè)試。各項(xiàng)目點(diǎn)使用統(tǒng)一供應(yīng)試劑。負(fù)責(zé)兩種方法的實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立盲法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

        6.倫理學(xué):本研究由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、美國(guó)帕斯適宜衛(wèi)生科技組織及香港公共衛(wèi)生檢測(cè)中心倫理委員會(huì)評(píng)審?fù)ㄟ^。

        結(jié) 果

        1.Z-N與LED法陽性涂片檢出率比較:總納入患者、初診可疑癥狀者及隨訪患者中使用LED法較Z-N法的陽性涂片檢出率均有提高,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。若不將鏡檢結(jié)果是實(shí)際條數(shù)(Z-N法:1~8條/300視野;LED法:1~9條/50視野)判斷為陽性,則Z-N法和LED法的陽性檢出率分別為7.97%(900/11288),和8.93%(1008/11288),后者較前者增加0.96%。

        表1 6個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同來源標(biāo)本2種鏡檢方法痰涂片陽性檢出率比較

        各實(shí)驗(yàn)室2種方法在總患者、初診可疑癥狀者及隨訪患者中痰涂片陽性檢出率的具體情況見表1。初診可疑癥狀者中陽性檢出率提高幅度最大達(dá)11.74%,最小僅0.30%,除3號(hào)實(shí)驗(yàn)室外其他實(shí)驗(yàn)室2種方法陽性涂片檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而在隨訪患者中,2個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用LED與Z-N法檢出率持平,除4號(hào)實(shí)驗(yàn)室有13.79%的提高外,其他實(shí)驗(yàn)室的提高幅度在0.76%~1.65%之間。

        2.Z-N與LED法鏡檢結(jié)果分布差異分析:11288張涂片使用Z-N和LED法檢測(cè)有2.91%(328/11288)存在定性差異。其中,Z-N 法為陰性的涂片有311張LED法判為陽性,其中有73.63%(229/311)被判讀為1~9條/50視野;相反,LED法為陰性的有10張涂片被Z-N法判為1~8條/300視野(表2)。

        3.讀片時(shí)間比較分析:使用Z-N法的平均讀片時(shí)間[(206.31±75.86)s] 明顯較LED法[(120.03±38.88)s] 長(zhǎng)(t=28.12,P=0.00)。其中,陰性結(jié)果使用LED法的平均時(shí)間較Z-N法短89.04s(t=30.47,P=0.00);陽性結(jié)果使用LED法的平均時(shí)間[(82.11±53.71)s] 較Z-N法[約(134.79±93.66)s] 節(jié)省52.68s(t=4.39,P=0.00)。2種方法閱讀不同陽性級(jí)別涂片所花費(fèi)的時(shí)間見表3。

        討 論

        本研究采用多中心研究方法評(píng)估了LED法在我國(guó)縣(區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用情況。結(jié)果顯示LED法的陽性涂片檢出率較Z-N法無論是在初診還是隨訪患者中均有提高,提示使用LED法不僅可以提高涂陽患者發(fā)現(xiàn)率,對(duì)療效判斷也會(huì)有較大影響。Steingart等[1]通過回顧多篇文章發(fā)現(xiàn),熒光染色傳統(tǒng)熒光顯微鏡較Z-N法陽性檢出率增加值范圍多數(shù)在0%~3%,但是其中幾項(xiàng)研究陽性檢出率增加值高達(dá)19%~33%,故平均陽性檢出率提高為9%(95%CI:5%~13%)。本研究結(jié)果Z-N法陽性涂片檢出率范圍為4.33%~11.96%,LED法陽性涂片檢出率范圍為5.06%~24.26%。LED法較Z-N法陽性檢出率增加值范圍為0.35%~12.79%。各縣(區(qū))結(jié)果差異較大,與各地肺結(jié)核疫情、患者就診時(shí)間是否延遲、實(shí)驗(yàn)室操作技術(shù)等均有關(guān)聯(lián)。

        表2 Z-N和LED法鏡檢結(jié)果分析(單位:份)

        表3 不同涂片結(jié)果在兩種方法中的讀片時(shí)間分析

        Z-N和LED法存在定性差別的涂片中60%以上來自于某一實(shí)驗(yàn)室。國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室對(duì)此實(shí)驗(yàn)室LED法涂片鏡檢的203張涂片(其中15張陰性,181張結(jié)果為“1~9條/50視野”和7張“1+”)進(jìn)行了Z-N法復(fù)檢,結(jié)果顯示,雖然該實(shí)驗(yàn)室省級(jí)熒光顯微鏡復(fù)檢與縣級(jí)LED法結(jié)果有較高的一致性(粗一致率約88.18%),但縣級(jí)檢測(cè)為“1~9條/50視野”的181張涂片中僅6張被Z-N法復(fù)檢為陽性,其余175張全部判斷為陰性,占96.69%。此實(shí)驗(yàn)室LED法初檢和使用傳統(tǒng)熒光顯微鏡復(fù)檢結(jié)果一致性較好;但用脫色后使用Z-N法復(fù)檢,大部分實(shí)際條數(shù)的涂片被判為陰性結(jié)果,可能有以下幾方面原因:(1)由于涂片結(jié)果本身是低陽性級(jí)別,含菌量少,在重新脫色和復(fù)染過程中少量菌丟失致使再次復(fù)檢時(shí)判為陰性結(jié)果。(2)Z-N法對(duì)低陽性級(jí)別結(jié)果涂片判讀本身存在一定局限性。(3)使用LED法在菌量較少情況下對(duì)菌的形態(tài)不容易辨認(rèn),因?yàn)闊o論是縣(區(qū))級(jí)還是省級(jí)以往均沒有很多熒光鏡檢方面的經(jīng)驗(yàn),所以可能在判斷時(shí)發(fā)生誤差。

        國(guó)際指南建議使用明場(chǎng)顯微鏡讀片至少5min[3],本研究顯示在常規(guī)工作狀態(tài)下使用Z-N法讀片時(shí)間不足4min,使用LED法約2min,時(shí)間明顯縮短,尤其表現(xiàn)在判讀陰性及陽性級(jí)別較低的涂片時(shí)。但同時(shí)需要注意的是本研究中使用Z-N法的讀片平均時(shí)間略短于國(guó)際指南推薦的5min,這也可能是影響陽性患者檢出率的一個(gè)可能原因,有報(bào)道50%的患者在常規(guī)工作中由于讀片時(shí)間不足可能被丟失[4]。

        中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施指南要求初診者收集3份痰標(biāo)本,隨訪患者收集2份痰標(biāo)本,但本研究顯示兩類人群均有部分患者沒有能夠按照要求收集痰標(biāo)本。收集3份痰標(biāo)本較單獨(dú)采集1份或2份痰標(biāo)本在陽性檢出率方面均有一定程度提高,但是痰標(biāo)本的數(shù)量對(duì)于累計(jì)陽性檢出率提高的影響在兩種鏡檢方法有所不同。收集2份痰標(biāo)本使用Z-N和LED法鏡檢累計(jì)丟失涂陽患者分別為10%和6%左右。一項(xiàng)綜述結(jié)果顯示,收集2份痰標(biāo)本且鏡檢質(zhì)量良好可以發(fā)現(xiàn)絕大部分(95%~98%)的涂陽患者[5]。這與本研究的結(jié)果有所差異,可能與痰標(biāo)本性狀、讀片時(shí)間、人員經(jīng)驗(yàn)等有一定關(guān)系。

        從本研究結(jié)果可以看出,LED與Z-N法相比陽性檢出率提高。其他研究結(jié)果顯示:若以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn),LED法的敏感度為84.0%,特異度為98.0%;與明場(chǎng)顯微鏡相比較,敏感度可提高6.0%,特異度沒有明顯降低;LED法與傳統(tǒng)熒光顯微鏡相比較,敏感度可提高5.0%,特異度可提高1.0%[1]。另外LED法可明顯縮短讀片時(shí)間,且染色時(shí)不需要加熱,此外操作人員對(duì)顯微鏡的對(duì)比度、信噪比、熒光均勻程度、聚焦容易度等評(píng)價(jià)均較滿意。但是在替換現(xiàn)有顯微鏡時(shí)需要考慮以下幾方面:(1)熒光染色抗酸菌形態(tài)不如Z-N法典型,尤其是菌量少的情況下不易與雜質(zhì)區(qū)分,對(duì)于不熟悉熒光鏡檢技術(shù)的實(shí)驗(yàn)人員更加明顯。(2)熒光染色涂片與Z-N法染色比較更加容易褪色,在實(shí)施痰涂片盲法復(fù)檢時(shí)需要將涂片重新脫色和染色之后進(jìn)行復(fù)檢,增加復(fù)檢實(shí)驗(yàn)室人員工作負(fù)荷。(3)在日樣本量低、且每日分多批次操作的實(shí)驗(yàn)室,由于熒光染色時(shí)間較現(xiàn)有方法長(zhǎng)(分別為15~20min、5min),可能需要較多的時(shí)間報(bào)告結(jié)果。綜合各方面,可優(yōu)先考慮選擇日工作量較大的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用LED法,然后逐步擴(kuò)展至其他實(shí)驗(yàn)室。

        志謝 感謝3省及6個(gè)縣區(qū)級(jí)實(shí)驗(yàn)室工作人員在研究現(xiàn)場(chǎng)的辛勤工作。感謝香港跨國(guó)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室、美國(guó)帕斯適宜衛(wèi)生科技組織在數(shù)據(jù)分析和撰寫過程中給予的指導(dǎo)和幫助

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        [2] 趙雁林.中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片顯微鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè).北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2009:7.

        [3] International Union Against Tuberculosis and Lung Disease(IUATLD)technical guide.sputum examination for tuberculosis by direct microscopy in low-income countries.5th ed.Paris:IUATLD.2000.

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