邵燕 朱永東 陶友愛 彭紅 李國莉 陳誠 許衛(wèi)國

根據(jù)世界衛(wèi)生組織2009年全球結(jié)核病報(bào)告顯示，中國是全球第二位的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家。目前，我國結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)主要依靠基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的痰涂片鏡檢技術(shù)。由于萋－尼（Ziehl－Neelsen，Z－N）染色和普通光學(xué)顯微鏡鏡檢具有操作簡單、特異度較高、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，雖然已有百余年的歷史，但仍是目前我國基層實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病的主要方法。但大量的研究也表明Z－N染色的痰涂片檢測肺結(jié)核的敏感度波動范圍較大，達(dá)20%～80%［1－3]，而金銨 O 或羅丹明熒光染色的痰涂片經(jīng)傳統(tǒng)熒光顯微鏡（fluorescence microscopy，F(xiàn)M）檢測，其敏感度平均可提高10%［4－5]。但傳統(tǒng)熒光顯微鏡的檢測成本過高，不適用于發(fā)展中國家。發(fā)光二極管熒光顯微鏡（light－emitting diodes，LED）很好地解決了該問題，同時(shí)相對于普通光學(xué)顯微鏡具有觀察時(shí)間短、應(yīng)用良好等優(yōu)點(diǎn)。

因此，中國衛(wèi)生部－蓋茨基金會結(jié)核病防治合作項(xiàng)目（簡稱“中蓋結(jié)核病項(xiàng)目”）結(jié)核病新診斷工具可行性子項(xiàng)目將LED技術(shù)引入我國結(jié)核病基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臨床應(yīng)用研究，江蘇省淮安市淮陰區(qū)參加了該項(xiàng)目的實(shí)施。為探討LED在基層臨床應(yīng)用效果，筆者對淮陰區(qū)驗(yàn)證階段的有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)器材

項(xiàng)目實(shí)施中，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡（conventional microscopy，CM）為奧林巴斯 CX21FS1－2；FM 為蔡司Imager A1，所用物鏡為20×；LED為蔡司Primo Star iLED，所用物鏡為20×。

二、研究對象

項(xiàng)目驗(yàn)證階段（2009年12月21日至2010年5月7日）淮陰區(qū)所有痰涂片，包括Z－N染色涂片和熒光染色涂片，分別為1941張和1940張。

三、驗(yàn)證設(shè)計(jì)

本項(xiàng)目共包括預(yù)試驗(yàn)、驗(yàn)證階段及示范階段3個(gè)部分。項(xiàng)目點(diǎn)檢驗(yàn)人員在培訓(xùn)后經(jīng)3周預(yù)試驗(yàn)熟悉熒光染色操作流程和LED的使用方法。此階段結(jié)束前由省級對項(xiàng)目點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)量評估和批量測試，合格后進(jìn)入下一階段。驗(yàn)證階段為12周，凡是該階段初診和隨訪結(jié)核患者均為納入對象，每份痰標(biāo)本涂2張玻片，分別進(jìn)行Z－N染色和熒光染色。項(xiàng)目點(diǎn)的2名實(shí)驗(yàn)室人員分別用普通光學(xué)顯微鏡和LED顯微鏡進(jìn)行讀片并報(bào)告結(jié)果，每2周輪換1次。此外，每2周由省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室（以下簡稱省級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室）對項(xiàng)目點(diǎn)的所有涂片進(jìn)行復(fù)核，其中復(fù)核熒光染色涂片時(shí)省級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室使用的是傳統(tǒng)熒光顯微鏡。所有涂片的最終結(jié)果以省級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室復(fù)核為準(zhǔn)。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（1）涂片染色及鏡檢：①Z－N染色：涂片自然干燥后，0.8%石碳酸復(fù)紅加熱染色，直至出現(xiàn)蒸汽，保持染色5min；流水輕緩沖洗，5%鹽酸乙醇脫色1min，流水沖洗；亞甲藍(lán)復(fù)染30s。②熒光染色：0.1%金銨O染色30min；流水輕緩沖洗，5%鹽酸乙醇脫色3min；最后滴加0.5%高錳酸鉀染色1min。（2）讀片：Z－N染色涂片經(jīng)10×目鏡及40×物鏡調(diào)節(jié)焦距，100×油鏡讀片；熒光染色涂片經(jīng)20×物鏡讀片。

以上詳細(xì)的操作步驟和判讀標(biāo)準(zhǔn)均按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》［6]進(jìn)行。

五、資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用增強(qiáng)配對卡方檢驗(yàn)（McNemar－Bowker test）對多分類計(jì)數(shù)配對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，2組實(shí)驗(yàn)的一致性比較使用Kappa檢驗(yàn)（Kappa值在0.75以上為較強(qiáng)，0.4～0.75為一般，0.4以下為較弱。利用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

驗(yàn)證階段淮陰區(qū)完成3882張涂片，包括Z－N染色和熒光染色，經(jīng)省級復(fù)核3881張涂片（其中1張熒光涂片由于運(yùn)輸后破損，未能復(fù)檢）。復(fù)檢后，Z－N染色涂片陽性片284張，陽性率（Z－N染色陽性涂片數(shù)／Z－N染色總涂片數(shù)）為14.6%，低假陽性4張，低假陰性9張，符合率99.3%；熒光染色涂片中陽性片464張，陽性率23.9%（熒光染色陽性涂片數(shù)／熒光染色涂片總數(shù)），低假陽性39張，低假陰性6張，符合率97.6%（表1）。

在所有的痰涂片中，至少1種方法判讀為陽性的共511張，其中LED陽性為498張，其中有1張LED陽性片因破損未能經(jīng)FM復(fù)核，F(xiàn)M陽性464張，而Z－N染色僅284張陽性。LED和FM不一致的共46張，6張F(tuán)M陽性而LED陰性，39張F(tuán)M陰性、LED陽性，1張F(tuán)M 1＋而LED 3＋；LED和Z－N染色不一致的共268張，其中Z－N染色陰性、LED陽性的有220張（表2，3）。經(jīng) McNemar－Bowker test檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LED和FM比較Kappa 值 為 0.903，LED 和 ZN 的 Kappa 值為0.409。

表1 淮陰區(qū)驗(yàn)證階段不同檢測方法痰涂片檢測結(jié)果（張）

為了比較Z－N染色和LED在發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者及患者隨訪過程中的差異，運(yùn)用回顧性研究統(tǒng)計(jì)了該階段部分患者的臨床診斷結(jié)果，分析其與Z－N染色及LED之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，對78例新發(fā)涂陽患者，2種方法的檢查結(jié)果一致，均為陽性；而在113例涂陰患者中，Z－N染色均為陰性，LED則檢出了14例陽性；另外，378例涂陽隨訪患者中有33例Z－N染色為陰性，而LED檢出為陽性（表4）。

討 論

目前我國基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)患者主要依靠Z－N染色CM鏡檢，但現(xiàn)有的研究表明，Z－N染色敏感度不高，陽性檢出率低；FM敏感度高于Z－N染色，但成本過高，不適用于我國基層實(shí)驗(yàn)室；而新近的LED技術(shù)相對于Z－N染色和FM敏感度均有明顯提高。本研究也表明，熒光染色LED讀片陽性率比Z－N 染色提高近10%。經(jīng) McNemar－Bowker test檢驗(yàn)，LED與Z－N染色及FM的比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。而 Kappa檢驗(yàn)提示LED和FM 的一致性較高（Kappa＝0.903），LED和Z－N染色則一致性一般（Kappa＝0.409）。結(jié)合上述McNemar－Bowker test檢驗(yàn)結(jié)果，說明LED在陽性率方面優(yōu)于Z－N染色。

表2 FM與LED檢測結(jié)果比較（張）

表3 Z－N染色與LED檢測結(jié)果比較（張）

表4 臨床診斷結(jié)果與Z－N染色及LED比較（例）

此外，在本研究中淮陰區(qū)2名工作人員分別獨(dú)立完成了1941張Z－N染色片和1940張熒光染色片的鏡檢工作，經(jīng)省級定期復(fù)檢后發(fā)現(xiàn)，Z－N染色和LED的符合率均達(dá)到了95%以上，但LED檢測的低假陽性誤判率高于Z－N染色。對于以上結(jié)果，筆者考慮可能相對于基層長期使用的Z－N染色鏡檢，檢驗(yàn)人員對于熒光染色技術(shù)和LED顯微鏡的把握度比較低，區(qū)分雜質(zhì)和菌體的能力還有待進(jìn)一步提高。

進(jìn)一步分別比較LED與Z－N染色和FM的差異，發(fā)現(xiàn)主要集中在定性區(qū)別上。其中，LED和FM符合度較高，均在1＋以內(nèi)，這和 Mizuno等［7]的研究結(jié)果類似。而LED和Z－N染色的結(jié)果差別明顯，甚至存在1＋以上的差別。

此外，筆者比較了部分納入患者臨床診斷結(jié)果與Z－N染色及LED的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LED和Z－N染色在新發(fā)涂陽患者的檢測中無差別，但是對涂陰患者的檢測結(jié)果有較明顯不同，LED比Z－N染色多檢出了14例陽性。與此同時(shí)LED的隨訪陽性率也明顯高于Z－N染色。國內(nèi)外很多研究都表明LED在敏感度和特異度方面明顯優(yōu)于Z－N染色，特別是LED和金標(biāo)準(zhǔn)改良羅氏（L－J）培養(yǎng)符合率很高，假陽性率明顯低于Z－N染色［8－9]。這提示在患者發(fā)現(xiàn)及療效隨訪過程中，LED可以更有效地提高患者發(fā)現(xiàn)率及指導(dǎo)臨床治療。

通過此次研究，筆者還發(fā)現(xiàn)LED在基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用過程中還有很多細(xì)節(jié)需要完善。特別是對于大部分檢驗(yàn)人員而言，熒光染色LED鏡檢技術(shù)還是比較陌生的，經(jīng)短期培訓(xùn)后仍然存在讀片效果反而低于Z－N染色的問題。最近一項(xiàng)在印度的研究也表明，雖然在很多方面LED檢測相對于Z－N染色和FM有明顯優(yōu)勢，但必須有足夠的培訓(xùn)和標(biāo)準(zhǔn)化操作才能確保其最大限度的準(zhǔn)確性［10]。因此，作為結(jié)核病診斷的新技術(shù)，LED具有很大的推廣價(jià)值，有利于我國的結(jié)核病發(fā)現(xiàn)和控制。但為了達(dá)到這一目標(biāo)，需要對檢驗(yàn)人員進(jìn)行系統(tǒng)、充分的操作培訓(xùn)，建立完善的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程和質(zhì)量保證體系，以幫助檢驗(yàn)人員迅速適應(yīng)并掌握該技術(shù)。

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