陳燕梅 錢明 江勇 陳濤 李海成 鐘球

目前痰涂片染色鏡檢常用有2種染色方法：萋－尼染色法 （簡稱Z－N染色法）和金胺O熒光染色法［1]。前者是使用已有百余年歷史的染色技術(shù)，因?yàn)槠洳僮骱唵巍①M(fèi)用低、速度快，1h可以報(bào)告結(jié)果而一直延用至今。這種方法在標(biāo)本量少，工作量不大的情況下是一種不錯(cuò)的篩查結(jié)核病檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法；但對(duì)于標(biāo)本量多、工作量大、實(shí)驗(yàn)人員少的單位，此法就難以滿足臨床需要，因此尋找一種更快速、靈敏的方法來幫助檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌就顯得尤為重要。

材料和方法

一、試劑和器材

熒光法染色液（包括金胺O初染液、脫色液、高錳酸鉀復(fù)染液）和Z－N染色液（包括石碳酸復(fù)紅液、脫色液、亞甲藍(lán)復(fù)染液）均按《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》［2]進(jìn)行配制；使用LEICA DM 1000發(fā)光二極管全冷光源熒光顯微鏡及奧林巴斯CH40生物顯微鏡。

二、檢測(cè)標(biāo)本

痰標(biāo)本來自2010年1月至2010年12月粵西地區(qū)2個(gè)縣結(jié)核病門診就診的可疑肺結(jié)核患者，全部為初診患者。本實(shí)驗(yàn)共收集232例患者的痰標(biāo)本696份。每位患者收集3份深咯痰標(biāo)本，分別為清晨痰、夜間痰和即時(shí)痰。標(biāo)本量為3～5ml，每份痰標(biāo)本涂抹2張玻片，分別進(jìn)行Z－N染色和金胺O熒光染色。

三、涂片

用竹簽挑取痰標(biāo)本的膿樣、血樣或干酪樣部分約0.05～0.1ml于玻片正面的右側(cè)2／3中央處，并均勻涂抹成1.0cm×2.0cm橢圓形痰膜，厚薄適中。室溫下自然干燥。

四、Z－N染色和金胺O熒光染色

均按《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢及質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行初染、脫色、復(fù)染。

五、鏡檢及結(jié)果判定

Z－N染色用普通光學(xué)顯微鏡鏡檢，10倍目鏡、100倍油鏡觀察。在淡藍(lán)色背景下，結(jié)核分枝桿菌呈紅色，其他細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。熒光染色用發(fā)光二極管顯微鏡，10倍目鏡、40倍物鏡觀察痰涂片，在暗視野背景下，結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)橘黃色熒光，呈桿狀或短棒狀。Z－N鏡檢結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)為：抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；抗酸桿菌陽性（報(bào)告抗酸桿菌菌數(shù)）：1～8條／300視野；抗酸桿菌陽性（1＋）：3～9條／100視野；抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條／10視野；抗酸桿菌陽性（3＋）：1～9條／每視野；抗酸桿菌陽性（4＋）：≥10條／每視野；報(bào)告1＋至少觀察300視野，2＋至少觀察100個(gè)視野，3＋、4＋時(shí)至少觀察50個(gè)視野。LED鏡檢結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)為：熒光染色抗酸桿菌陰性：0條／50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（報(bào)告抗酸桿菌菌數(shù)）：1～9條／50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（1＋）：10～49條／50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條／每視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（3＋）：10～99條／每視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（4＋）：＞100條／每視野；報(bào)告2＋至少觀察50視野，3＋及以上至少觀察20個(gè)視野。

六、資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，率采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

LED組232例可疑結(jié)核病患者的痰標(biāo)本中檢出88例陽性，陽性率為37.9%；Z－N組檢出62例陽性，陽性率為26.7%；χ2＝6.66，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。在檢測(cè)1＋或以下菌量的標(biāo)本時(shí)，LED組鏡檢組陽性率為14.22%，Z－N組陽性率為6.17%；χ2＝24.59，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。兩種染色方法均以干酪痰陽性檢出率最高，干酪痰涂陽率＞黏液痰涂陽率＞唾液痰涂陽率，它們的涂片陽性率分別為 78.9%、23.9%、7.5%和81.6%、38.3%、11.9%（表3）。表3結(jié)果還顯示，LED組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝50.00，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝100.73，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較χ2＝33.16，P＜0.01。Z－N組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝92.7，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝111.52，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較χ2＝17.50，P＜0.01。

表1 Z－N染色和金胺O熒光染色結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果分析（例）

表2 Z－N染色和金胺O熒光染色結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果比較

表3 兩組不同性狀痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌陽性檢測(cè)結(jié)果

討 論

LED方法染色鏡檢時(shí)抗酸桿菌在暗視野背景下發(fā)出橘黃色熒光，黑色背景與抗酸桿菌對(duì)比鮮明，非常明顯容易發(fā)現(xiàn)，熒光染色讀片放大倍數(shù)為400倍（40倍物鏡，10倍目鏡），所觀察的視野面積大，故它的靈敏度比Z－N方法普通顯微鏡鏡檢高［3－4]；LED 組 與 Z－N 組 在 特 異 度 上 亦 無 差 異［5]。本研究結(jié)果顯示，LED組檢出陽性率為37.9%，Z－N組為26.7%，χ2＝6.66，P＜0.01，兩者的陽性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組陽性檢出率差異主要體現(xiàn)在結(jié)果為1＋及以下的標(biāo)本，即含菌量少的痰標(biāo)本上，LED 組為14.2%，Z－N 組6.2%，χ2＝24.59，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而2＋、3＋、4＋的陽性率P值均大于0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明痰標(biāo)本含菌量較少時(shí)直接涂片LED法鏡檢較Z－N法具有更高的靈敏度，這樣可防止漏診的出現(xiàn)，對(duì)于那些病變活動(dòng)性輕、排菌量較少的肺結(jié)核診斷具有重要意義，及時(shí)準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)這部分具有傳染性的肺結(jié)核患者對(duì)于我國的結(jié)核病預(yù)防控制、流行病學(xué)調(diào)查、治療等有重大意義。

結(jié)果同時(shí)顯示，兩種染色方法均以干酪痰陽性檢出率最高，干酪痰涂陽率＞黏液痰涂陽率＞唾液痰涂陽率，它們的涂片陽性率分別為78.9%、23.9%、7.5%和81.6%、38.3%、11.9%。血痰是干咳引起的細(xì)支氣管破裂出血或病灶出血與膿痰或黏液痰混合而成的標(biāo)本，故根據(jù)肉眼判斷而將之歸為干酪痰或黏液痰。LED組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝50.00，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝100.73，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較，χ2＝33.16，P＜0.01；Z－N 組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝92.70，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝111.52，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較，χ2＝17.50，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示為了提高結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)率和痰檢陽性率，無論采用何種的檢測(cè)方法都應(yīng)注意收集合格的痰標(biāo)本，尤其是收集膿性干酪樣的痰標(biāo)本進(jìn)行檢查，痰標(biāo)本的質(zhì)量直接影響檢驗(yàn)的結(jié)果。

熒光染色讀片放大倍數(shù)為400倍（40倍物鏡，10倍目鏡），所觀察的視野面積大，觀察相同面積視野所需時(shí)間短，報(bào)告陰性結(jié)果只需讀片50個(gè)視野（通常需2min左右）。由于讀片時(shí)間短，所以可加快痰標(biāo)本的篩查速度。而Z－N法鏡檢讀片放大倍數(shù)為1000倍（100倍物鏡，10倍目鏡），油鏡觀察視野范圍小，報(bào)告陰性結(jié)果需讀片300視野或需讀片5min左右；鏡檢人員容易出現(xiàn)視覺疲勞。往往容易漏診掉一些菌含量少的痰液標(biāo)本，亦往往制約檢驗(yàn)人員的工作量。因此LED鏡檢更適合用于工作量大、標(biāo)本量多的單位使用，可提高工作效率，及時(shí)滿足臨床早期診斷的需要。

LED法較Z－N法有節(jié)約試劑、減少試驗(yàn)成本、簡化操作的優(yōu)勢(shì)。染色時(shí)無需加熱，可降低實(shí)驗(yàn)人員因加熱而吸入有害物質(zhì)的危險(xiǎn)。不需使用鏡油和擦鏡紙等消耗品，LED法與Z－N法染色1張涂片所需的初染液、脫色液、復(fù)染液的用量基本相同，每張涂片需初染液、復(fù)染液各約3ml，需脫色液約6ml，購買試劑的費(fèi)用亦相差不多。而LED法省略了初染色加熱、滴加鏡油和擦鏡的步驟，故無論在操作流程或者成本上都比Z－N法略勝一籌。

直接痰涂片染色鏡檢時(shí)，LED法檢測(cè)比Z－N法具有讀片時(shí)間短、操作容易、檢出率高（特別是對(duì)含菌量少的痰標(biāo)本）、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是一種檢查結(jié)果可靠、敏感度較高、工作效率高的方法，所以更適合結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室開展。痰涂片的某些雜質(zhì)經(jīng)過熒光染色在LED鏡下都呈現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌相似的黃色桿狀或短棒狀，這就需要很有讀片經(jīng)驗(yàn)的人來區(qū)分細(xì)菌與雜質(zhì)，包括治療前后細(xì)菌形態(tài)的變化，讀片的人要熟練掌握和識(shí)別抗酸桿菌的形態(tài)，所以對(duì)沒有熒光鏡檢經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，在開展LED方法前，有必要開展熒光涂片和讀片培訓(xùn)。

［1] 中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程.北京：中國教育文化出版社，2006：13－29.

［2] 中國疾病預(yù)防控制中心.中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè).北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2004：23－51.

［3] Albert H，Manabe Y，Lukyamuzi G，et al.Performance of three LED－based fluorescence microscopy systems for detection of tuberculosis in Uganda.PLoS One，2010，5（12）：e15206.

［4] 尚美，劉冠，趙立平，等.發(fā)光二極管熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)室診斷效果評(píng)價(jià).中國防癆雜志，2010，32（5）：275－278.

［5] Anthony RM，Kolk AH，Kuijper S，et al.Light emitting diodes for auramine O fluorescence microscopic screening of Mycobacterium tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis，2006，10（9）：1060－1062.