范志宏，郭春絨，王金勝

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山西太谷030801）

西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum f sp niveum，F(xiàn)ON）引起的毀滅性土傳病害，其在我國各西瓜產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，已成為影響西瓜生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一[1-2]。目前,防治該病主要采用嫁接、化學(xué)農(nóng)藥熏蒸土壤、化學(xué)殺菌劑噴灌等，嫁接是最有效的方法，但生產(chǎn)成本較高。使用化學(xué)藥劑防治，對(duì)環(huán)境污染大，對(duì)牲畜有毒[3]。因此，研究和開發(fā)對(duì)西瓜枯萎病有效的新型殺菌劑具有重要的意義。而由于菊科植物萬壽菊（Tagetes patula）花、葉及根中含有具有特殊活性的化合物而受到特別的重視。國外有關(guān)于萬壽菊的化學(xué)成分和昆蟲活性[4]的報(bào)道。但是，對(duì)萬壽菊殺菌、抑菌活性方面的研究較少[3-5]。

本試驗(yàn)采用菌碟法和田間試驗(yàn)方法研究萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)西瓜枯萎病病原菌的抑菌活性以及作用機(jī)理，以期為開發(fā)防治西瓜枯萎病的植物源新農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試西瓜品種 蘭州P2，感病品種。

1.1.2 供試菌株 西瓜枯萎病菌，辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum），辣椒疫霉病菌（Phytophthpra capsici Len），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系提供。將菌種接種到培養(yǎng)皿內(nèi)，25℃無光倒置，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.1.3 萬壽菊殺菌素Ⅰ 其為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)萬壽菊殺菌素研究課題組合成。

1.1.4 西瓜枯萎病病原菌毒素粗提液 用理查德液體培養(yǎng)基，在25℃，100 r/min振蕩，3 000 lx光照條件下培養(yǎng)西瓜枯萎病菌，20 d后離心濾液（5 000 r/min，15 min），收集上清液即為西瓜枯萎病菌的毒素粗提液。鐮刀菌酸的定量以Sigma公司的鐮刀菌酸為標(biāo)準(zhǔn)，用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量[5]。

1.2 方法

1.2.1 抑菌試驗(yàn) 采用菌碟法：用打孔器從事先培養(yǎng)純化好的菌種中采菌，接種到含0.001，0.010，0.100，1.000 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的PDA培養(yǎng)基上，并作空白對(duì)照（無藥劑的培養(yǎng)基），25℃恒溫培養(yǎng)，36，48 h后記錄菌絲生長直徑。重復(fù)3次，計(jì)算相對(duì)抑制率。

1.2.2 田間試驗(yàn) 挑選飽滿的西瓜種子，分別用A溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液（鐮刀菌酸含量為4.005 5 μg/mL）和10 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液）、B溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和5 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液）、C溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液）、CK（無菌水）浸種6 h，然后用無菌水沖洗干凈后用濕紗布包好種子，放1～2倍種子量的無菌沙子，在25℃左右黑暗催芽。當(dāng)CK有50%～60%種子露白后播種于田間（氣溫25℃左右）。每處理重復(fù)3次。在第1片真葉完全展開時(shí)（苗期）作如下處理：處理A，A溶液浸種的西瓜苗再用含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和10 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液灌根；處理B，B溶液浸種的西瓜苗再用80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和5 μg/mL萬壽菊殺菌素Ⅰ的混合液灌根；處理C，C溶液浸種的西瓜苗再用80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液灌根；CK，無菌水浸種的西瓜苗再用無菌水灌根。每種處理使用相同藥劑液量（約10 mL/株），每處理2株，重復(fù)3次。

1.2.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定 對(duì)苗期的植株168 h內(nèi)分別測(cè)定如下指標(biāo)：（1）CAT活性，采用Ti4+絡(luò)合法[5]測(cè)定；（2）SOD活性，采用 NBT光還原法[6]測(cè)定；（3）POD活性，采用愈創(chuàng)木酚法[6]測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)不同致病菌菌絲生長的影響

2.1.1 萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長的影響 萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)西瓜枯萎病菌有明顯抑制作用（表1），在質(zhì)量濃度為0.010 μg/mL時(shí)，抑制效果不明顯，在達(dá)到0.100 μg/mL后，抑制效果顯著。與36 h的抑制率相比，48 h低質(zhì)量濃度的抑制率變化不大，而高質(zhì)量濃度的抑制率顯著下降。說明隨著質(zhì)量濃度的增高，萬壽菊殺菌素Ⅰ的抑菌作用增強(qiáng)；而隨著時(shí)間的延長，抑制作用降低。說明萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制既有時(shí)間效應(yīng)又有質(zhì)量濃度效應(yīng)。

表1 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制率 %

2.1.2 萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)辣椒疫霉病菌菌絲生長的影響 隨著藥劑質(zhì)量濃度的增大，萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)辣椒疫霉病菌的抑制作用呈增大趨勢(shì)（表2），說明萬壽菊殺菌素I對(duì)于辣椒疫霉病菌有質(zhì)量濃度效應(yīng)。但是隨著時(shí)間的推移，抑制作用降低，說明萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)辣椒疫霉病菌的抑制作用具有時(shí)間效應(yīng)和質(zhì)量濃度效應(yīng)。

表2 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)辣椒疫霉病菌的抑制率 %

2.1.3 萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)辣椒枯萎病菌菌絲生長的影響 對(duì)于辣椒枯萎病菌，萬壽菊殺菌素Ⅰ的抑制作用在質(zhì)量濃度最大時(shí)比較明顯（表3），在相對(duì)較低質(zhì)量濃度的藥劑處理下抑制作用變化不明顯。在藥劑質(zhì)量濃度達(dá)到0.100 μg/mL以后，對(duì)辣椒枯萎病菌的抑制作用明顯。隨著時(shí)間的推移，其抑制作用變化不明顯，說明在本試驗(yàn)范圍內(nèi)萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)于辣椒枯萎病菌的抑制作用有閾值效應(yīng)。

2.2 萬壽菊殺菌素Ⅰ及毒素處理對(duì)西瓜幼苗的CAT，POD和SOD活性的影響

2.2.1 處理對(duì)CAT活性的影響 西瓜苗期過氧化氫酶（CAT）活性波動(dòng)幅度較大（圖1）。圖1結(jié)果說明，在西瓜苗期，植物本身生長勢(shì)弱，自身抗性差，因而在毒素作用下，西瓜的CAT活性降低。當(dāng)有萬壽菊殺菌素Ⅰ存在時(shí)（處理A、處理B），其CAT的活性提高，說明萬壽菊殺菌素Ⅰ可起到消除枯萎病菌毒素對(duì)西瓜的毒害作用，而且該作用隨萬壽菊殺菌素Ⅰ濃度增大而增大。

表3 不同質(zhì)量濃度萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)辣椒枯萎病菌的抑制率 %

2.2.2 處理對(duì)POD活性的影響 在西瓜苗期POD酶明顯受到影響（圖2）。圖2結(jié)果說明，隨著西瓜的自然生長，POD活性趨于穩(wěn)定。經(jīng)過萬壽菊殺菌素Ⅰ加毒素處理的植株（處理A、處理B），POD活性始終高于對(duì)照，說明萬壽菊殺菌素Ⅰ可較長時(shí)間作用于植株，提高植株的抗病性。

2.2.3 處理對(duì)SOD活性的影響 當(dāng)用毒素處理時(shí)（處理C），西瓜SOD活性下降；萬壽菊殺菌素Ⅰ加毒素的處理中（處理A、處理B），SOD活性高于對(duì)照，恢復(fù)到正常水平（圖3），說明萬壽菊殺菌素Ⅰ能提高SOD活性。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，萬壽菊殺菌素Ⅰ有較好的抑菌效果。通過在西瓜枯萎病的主要發(fā)病期苗期施用萬壽菊殺菌素Ⅰ，植株體內(nèi)生理生化指標(biāo)有較大變化，表明萬壽菊殺菌素Ⅰ能有效減輕西瓜枯萎病菌對(duì)植株的毒害作用。

萬壽菊殺菌素Ⅰ不但可以抑制西瓜枯萎病菌，還可以促進(jìn)植株生長。這可能與萬壽菊殺菌素Ⅰ一方面誘導(dǎo)了幼苗的抗性，另一方面與萬壽菊殺菌素Ⅰ對(duì)毒素有一定的鈍化作用有關(guān)。前人研究表明[7]，CAT，SOD和POD這3個(gè)酶與植物抗病有關(guān)。SOD，POD可減輕毒素對(duì)根系膜系統(tǒng)的破壞，減輕質(zhì)膜傷害的程度；POD能清除逆境下植株體內(nèi)產(chǎn)生的有害自由基；SOD專一清除O2-，并抑制毒性更強(qiáng)的·OH生成[8]；CAT可分解體內(nèi)的過氧化物，是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用保護(hù)系統(tǒng)的主要成分之一[9]。本試驗(yàn)中，萬壽菊殺菌素Ⅰ的施用提高了SOD，POD的活性，并可維持CAT活性，因此，萬壽菊殺菌素Ⅰ的施用能提高西瓜植株內(nèi)保護(hù)酶活性，降低膜脂過氧化作用，保護(hù)生物膜，有效地抑制了西瓜枯萎病菌的為害。

深入研究植物源抑菌劑的作用機(jī)理并設(shè)計(jì)完全新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物，是當(dāng)前尋找新型、高效抑菌劑的主要途徑。萬壽菊根提取物中抑菌活性主成分的人工合成及其抑菌作用機(jī)理需要作進(jìn)一步的研究探討。

本研究為新農(nóng)藥的開發(fā)和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為開發(fā)新的防治西瓜枯萎病的植物源農(nóng)藥提供了一定的理論基礎(chǔ)。

［1］李紅霞，曲俊民，南建福.西瓜載體播種的經(jīng)濟(jì)效益分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（5）：56-58.

［2］劉新濤，劉玉霞，倪云霞，等.西瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的篩選[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（9）：94-96.

［3］范志宏，郭春絨，王金勝.萬壽菊根提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌活性成分及作用機(jī)理研究 [J].植物病理學(xué)報(bào)，2010，40（2）：195-201.

［4］ Gao Y X，Nagy B，Liu X，et al.Supercritical CO2extraction of lutein esters from marigold （Tagetes erecta L.）enhanced by ultrasound[J].The Journal of Supercritical Fluids，2009，49（3）：345-350.

［5］陳紅兵，王金勝，張作剛，等.萬壽菊根的提取物對(duì)西瓜枯萎病反應(yīng)的抗性研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（5）：439-443.

［6］王金勝.農(nóng)業(yè)生物化學(xué)研究技術(shù) [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：140-172.

［7］武予清，韓松，李素娟，等.棉籽餅提取液對(duì)植物病原菌的抑制作用及其成分分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（4）：103-105.

［8］王美琴，陳俊美，李新鳳.不同碳、氮源對(duì)番茄兩種內(nèi)生真菌菌絲生長的影響研究 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（11）：75-77.

［9］李煜昶，岳銘秀，董景華，等.新三唑類化合物的生物活性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1999，14（1）：79-83.