王賢波 崔紅春 黃海濤

(杭州市農業(yè)科學研究院，浙江杭州 310024)

茶葉中兒茶素(catechin)是茶葉中重要的一類天然活性物質，是天然的抗氧化劑和自由基清除劑，被廣泛的應用于食品加工、醫(yī)藥保健等領域［1，2，3］。兒茶素占茶葉中茶多酚總量的60% ～80%，主要有表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)及表兒茶素(EC)等［3，4］。大量實驗已證明兒茶素具有抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基、壓制黑色素合成等作用［2］。有研究表明 EGC的抗氧化能力僅次于EGCG［5］。因此，EGC 的提取制備研究具有重要意義。

響應面方法(Response Surface Methodology，RSM)是20世紀中后葉發(fā)展起來的優(yōu)化試驗條件統(tǒng)計學方法［6］，利用合理的試驗設計并通過實驗得到的一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，它可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，它已成為精度高、應用廣并具有實用價值的優(yōu)化技術［7］，因此被廣泛地應用于條件優(yōu)化和模型建立中。

本文用去離子水浸提茶葉中的EGC，在單因素實驗的基礎上，利用響應面法對EGC的浸提條件進行優(yōu)化，得到最佳浸提條件，為后期提純提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

茶葉:采自余杭徑山茶園。

1.2 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀(美國Waters公司)，電子天平(METTLER公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

甲酸、乙腈為色譜純，EGC標準品(Sigma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶葉中EGC浸提 茶葉過20目篩，用去離子水浸提，稱取50 g綠茶粉末于燒杯中，加入一定量去離子水，在恒溫水浴鍋中于一定溫度下浸提一定時間后，過濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測EGC含量。

1.3.2 EGC浸出率的測定 取 EGC標準樣用HPLC法測定濃度－峰面積標準線性方程如下:

式中，Y為峰面積(μV·S);X為EGC的質量濃度 (mg/L);方程的線性相關系數(shù)為0.9998679;色譜條件:以0.5%的甲酸和乙腈為流動相梯度洗脫，檢測波長為280 nm，流速為1 mL/min。

EGC浸出率由下式計算:

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去離子水，浸提1次，pH 6.0，在恒溫水浴鍋中于80℃下浸提不同時間，過濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測EGC含量，計算EGC浸出率，結果見圖1。

圖1 浸提時間對EGC浸出率的影響

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去離子水，浸提1次，pH 6.0，在不同溫度下浸提20 min，過濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測EGC含量，計算EGC浸出率，結果見圖2。

取50 g綠茶粉末于燒杯中，浸提1次，pH 6.0，在80℃下浸提20 min，按照不同料液比進行浸提，過濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測EGC含量，計算EGC浸出率，結果見圖3。

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比，浸提1次，在80℃下浸提20 min，在不同pH值下浸提，過濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測EGC含量，計算EGC浸出率，結果見圖4。

圖4 浸提pH對EGC浸出率的影響

取50 g綠茶粉末于燒杯中，按照1∶12料液比加入600 mL去離子水，pH 6.0，在80℃下浸提20 min，浸提不同次數(shù)，過濾，得茶多酚浸提液，用高效液相色譜法檢測EGC含量，計算EGC浸出率，結果見圖5。

由圖1可知，在20分鐘時EGC浸出率最大，之后逐漸下降，可能是隨著時間的延長，EGC發(fā)生了異構反應。由圖2可知，隨著溫度升高，EGC浸出率先升高后降低，這可能是因為隨著溫度的升高EGC變得不穩(wěn)定，發(fā)生了異構反應。由圖3可知，隨著料液比的增加，EGC浸出率隨之增加，但是1∶12之后變化不明顯，而且隨著溶劑的增加會給后續(xù)處理帶來麻煩，所以料液比不宜過大，本實驗選擇料液比為1∶12。由圖4可知，EGC的浸出率隨著pH值的升高先變大后降低，在酸性環(huán)境中可能是沒食子基團在起作用，容易與酸結合，導致游離的EGC減少［8］，pH值升高可能引起EGC氧化。由圖5可知，EGC浸出率隨著次數(shù)的增加而增加，但從浸提2次以后浸出率的變化不明顯。

圖5 浸提次數(shù)對EGC浸出率的影響

2.2 響應面法優(yōu)化EGC的浸提條件

根據(jù)單因素實驗結果，在選定料液比為1∶12，浸提2次的前提下，采用Box-Benhnken實驗設計進行三因素三水平的響應面分析實驗，包括12個析因實驗和3個中心實驗。以浸提溫度，浸提時間，pH為自變量，以EGC浸出率為響應值，實驗因素與水平的選取見表1，響應面實驗的結果見表2。

表1 因素與水平取值表

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及實驗結果

利用統(tǒng)計軟件MINITAB15對實驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，然后對回歸方程進行方差分析，結果見表3。

利用MINITAB15回歸擬合實驗數(shù)據(jù)，獲得EGC浸出率對浸提溫度，浸提時間，pH的三元二次回歸方程:Y=1.93333 －0.06A －0.0425B+0.0625C －0.15917A2－ 0.11417B2－ 0.19417C2－ 0.01AB －0.02AC+0.025BC。由回歸方程的方差分析結果(表3)可以看出，該模型失擬不顯著，回歸顯著。另外該模型決定系數(shù)R2=0.9761，說明回歸方程的擬合程度較好，預測值和實測值之間具有高度的相關性，因此該模型可以應用于EGC浸出率的理論預測。EGC浸出率響應面分析關鍵點值見表4。

表3 回歸方程的方差分析

表4 EGC浸出率響應面分析關鍵點值

由表4可知，該回歸模型存在穩(wěn)定點，EGC浸出率的最大估計值1.9475%，3個因素取值分別為:浸提溫度78.0808℃、時間18.4848 min、pH 6.1515。結合單因素實驗結果，為計算方便各因素取整數(shù)得到 EGC 浸提優(yōu)化條件:料液比 1∶12、pH 6.2、溫度78℃、時間 18 min、浸提 2次。圖 6－8為通過MINITAB15得到的響應面分析圖及其等高線圖，每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，由響應面圖可以看出:浸提溫度、浸提時間、pH與EGC浸出率存在相關性。利用得到的優(yōu)化條件進行浸提驗證，得到EGC浸出率為2.0%，說明該模型可以應用于EGC浸出率的預測。

3 小結

本實驗用去離子水浸提茶葉中的EGC，在單因素實驗的基礎上，利用響應面法對EGC的浸提條件進行優(yōu)化，得到最佳浸提條件:料液比1∶12、pH 6.2、溫度78℃、時間18 min、浸提2次。通過驗證實驗表明，該模型可以應用于EGC浸出率的預測。

1 劉學銘，梁世中.茶多酚的保健和藥理作用及應用前景.食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，24(5):47 －51，71.

2 趙麗萍，邵宛芳.茶葉中EGCG功效研究進展.中國農學通報，2007，23(7):143 －147.

3 焦蓓蓓.茶多酚的藥理作用研究進展.亞太傳統(tǒng)醫(yī)學，2009，5(1):131－133.

4 劉世初，孫志洪，王 斌.茶多酚的提取工藝及其應用機理研究進展.家畜生態(tài)學報，2009，30(4):91 －94.

5 高永貴，楊賢強，周樹紅.試論茶多酚清除自由基的高效性.天然產物與研究開發(fā)，1999，11(2):82 －86.

6 胡運權.試驗設計方法.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學出版社，1997:153－154.

7 慕運動.響應面方法及其在食品工業(yè)中的應用.鄭州工程學院學報，2001，22(3):91 －94.

8 陳利燕，屠幼英，陳暄等.兒茶素在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性研究.茶葉，2002，28(2):86 －88.