許呂宏， 方建培， 翁文駿， 潘 莉

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院兒科，廣東廣州510120)

化學藥物治療是白血病治療的主要手段之一，成人白血病化療后5年生存率約40%，兒童白血病化療后5年生存率約80%［1］。BCR/ABL基因是人體細胞第9號染色體ABL原癌基因與第22號染色體BCR基因相互易位形成的融合基因，可引起蛋白激酶持續(xù)性活化，是白血病不良預后因素之一［2］。臨床發(fā)現(xiàn)有部分患者對該化療藥物不敏感，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，應用分子靶向治療是解決該問題的新策略。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種細胞內非受體型酪氨酸激酶。FAK基因定位于人染色體8q24，編碼1 052個氨基酸，其蛋白質分子量為125 kD。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK在正常細胞的生長周期、增殖分化、遷移運動及血管生成等過程均發(fā)揮重要作用;并且，F(xiàn)AK在多種腫瘤細胞中高表達，在腫瘤細胞激活過程及侵襲轉移中也起關鍵作用，漸成為目前腫瘤治療的新靶點［3，4］。本實驗擬應用 BCR/ABL－BaF3白血病細胞株為研究對象，構建FAK shRNA慢病毒載體，通過體外及動物體內實驗研究FAK基因沉默對白血病細胞生長的影響。

材料和方法

1 材料及動物

BCR/ABL－BaF3白血病細胞株由美國哈佛大學波士頓兒童醫(yī)院Le Yi博士惠贈。RPMI－1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Invitrogen，抗FAK單克隆抗體購自 Upstate，抗 β－actin、STAT5、p－STAT5、caspase－3、caspase－9單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基MethoCult? M3630購自Stem Cells。無特定病原體(SPF級)BALB/c小鼠，雄性，6－8周，體重18－20 g，由中山大學北校區(qū)實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。

2 FAK shRNA轉染

按照文獻［5］方法，應用含綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)基因的慢病毒載體，插入FAK shRNA序列，經篩選得到最有效的FAK shRNA序列是5’－GGAATGCTTCAAGTGTGCT－3’。體外應用RPMI－1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)BCR/ABL－BaF3白血病細胞株，分別將FAK shRNA或空白對照的慢病毒轉染至該細胞株中，流式細胞儀分選轉染后GFP陽性細胞用于實驗研究。

3 Western blotting檢測

流式分離轉染后GFP陽性的BCR/ABL－BaF3細胞，應用細胞裂解液提取細胞總蛋白。分別取蛋白100 μg上樣，經10%SDS－PAGE凝膠電泳后轉至二氟化樹脂(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，PVDF膜用5% 脫脂奶室溫封閉2 h。分別加入1∶200 I抗(抗 FAK、β－actin、STAT5、p－STAT5、caspase－3、caspase－9等單克隆抗體)，4 ℃輕搖過夜。TBS洗膜3次后加1∶5 000 II抗(山羊抗小鼠IgG)，室溫平衡1 h。TBS洗膜3次后ECL顯色。應用專門的圖像分析軟件計算顯影的強度。

4 白血病細胞生長及集落培養(yǎng)

4.1 體外細胞增殖生長 流式細胞儀分選GFP陽性白血病細胞于體外培養(yǎng)，取2×105白血病細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI－1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天計算細胞數(shù)量的增殖情況。

4.2 細胞集落培養(yǎng) 取5×102白血病細胞重懸于100 μL PBS緩沖液，然后置于1 mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系進行集落培養(yǎng)，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，計數(shù)白血病細胞集落，以細胞數(shù)大于40個為一個集落。

5 FAK shRNA抑制白血病生成

5.1 白血病動物模型的建立 調整轉染后BCR/ABL－BaF3白血病細胞濃度至5 ×1010/L，取1×106(0.2 mL)白血病細胞經尾靜脈輸注到BALB/c小鼠體內。取含F(xiàn)AK shRNA白血病細胞組為實驗組，不含F(xiàn)AK shRNA白血病細胞為對照組，每組小鼠15只。

5.2 白血病生成檢測 每天觀察小鼠的生存情況，記錄死亡時間，繪制生存曲線。白血病細胞輸注后第25 d，分別處死5個小鼠(實驗組和對照組)，分離小鼠脾臟，比較脾臟腫大情況，流式細胞儀檢測脾臟中GFP陽性細胞表達率。

6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，應用t檢驗或單因素方差分析;繪制Kaplan－Meier生存曲線并進行l(wèi)og－rank檢驗，檢驗水準設α=0.05。

結 果

1 Western blotting檢測蛋白表達水平

含F(xiàn)AK shRNA慢病毒載體轉染至白血病細胞為FAK基因沉默組，不含F(xiàn)AK shRNA的慢病毒載體轉染白血病細胞為空白載體對照組，分別應用流式細胞儀檢測GFP陽性百分比，結果示2組的轉染率為21%－32%，差異無顯著(P＞0.05)。如圖1所示，與空白載體對照組相比，F(xiàn)AK shRNA能明顯抑制細胞FAK蛋白水平的表達，見圖1A。FAK shRNA對細胞內STAT5蛋白表達無顯著影響，而明顯降低STAT5蛋白磷酸化水平，見圖1B。FAK shRNA可引起細胞內caspases－3活化，見圖1C，而對caspases－9的活化無顯著影響，見圖1D。

Figure 1.Western blotting analysis protein expression and caspases activity.A:FAK expression;B:STAT5 phosphorylation;C:caspase－3activation;D:caspase－9 activation.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs vector group.圖1 Western blotting檢測蛋白表達水平及caspase活性

2 體外實驗中FAK shRNA抑制細胞生長

分別取2×105空白載體對照組及FAK shRNA組的白血病細胞體外培養(yǎng)3 d，每天計算細胞數(shù)量的增殖情況。如圖2所示，第24 h，空白載體對照組與FAK shRNA組細胞計數(shù)分別為(2.60±0.26)×105和(2.16±0.28)×105，2組差異無顯著(P＞0.05);第48 h，空白載體對照組與FAK shRNA組細胞計數(shù)分別為(4.50±0.50)×105和(3.43±0.32)×105，2組差異顯著(P＜0.05);體外培養(yǎng)第72 h，2組細胞計算分別為(8.13±0.61)×105和(5.20±0.53)×105，2組差異顯著(P＜0.01)，提示 FAK shRNA能抑制細胞生長。另外，取5×102白血病細胞于甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7 d，集落計數(shù)結果發(fā)現(xiàn)，空白載體對照組與FAK shRNA組中集落數(shù)量分別為215.60±13.01和125.00±9.06，2組差異顯著(P＜0.01)，提示FAK shRNA抑制細胞集落形成。

Figure 2.Cell growth and colony formation in vitro.A:cells growth in RPMI－1640 medium for 72 h;B:colony formation in methylcellulose medium for 7 d.±s.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs vector group.圖2 體外實驗中細胞生長及集落形成情況

3 動物體內實驗示FAK shRNA抑制白血病細胞生長

取1×106BCR/ABL－BaF3白血病細胞經尾靜脈輸注到BALB/c小鼠體內建立白血病動物模型。生存分析顯示，空白載體對照組的小鼠于白血病細胞輸注的第21－27 d全部死亡，生存中位數(shù)是24 d;而FAK shRNA組小鼠于白血病細胞輸注的第52－60 d全部死亡，生存中位數(shù)是55 d，2組差異顯著(P＜0.05)，見圖3A。白血病細胞輸注后第25 d分離小鼠脾臟，發(fā)現(xiàn)白血病小鼠脾臟比正常小鼠脾臟明顯腫大;與空白載體對照相比，F(xiàn)AK shRNA能明顯減輕脾臟腫大，見圖3B。空白載體對照組與FAK shRNA組小鼠脾臟中GFP陽性細胞百分比分別為(82.40±6.13)%和(14.50±3.70)%，2組差異顯著(P＜0.01)。結果表明FAK shRNA能抑制白血病細胞生長。

討 論

Figure 3.FAK shRNA inhibits the growth of BCR/ABL－BaF3 cells in vivo.A:survival curves of mice after injection of BCR/ABL－BaF3 cells;B:leukemic mice developed splenomegaly on day 25，but FAK silencing reduced the size of spleen compared with the vector.The volume of spleen in normal group，vector group and FAK shRNA group was(0.22±0.07)cm3，(1.60±0.25)cm3and(0.51±0.12)cm3，respectively.n=3.圖3 動物體內實驗示FAK shRNA抑制白血病細胞生長

BaF3細胞是一種來源于小鼠前B淋巴細胞的白血病細胞株，體外培養(yǎng)依賴細胞因子IL－3;而轉染BCR/ABL基因的BaF3細胞的生長不需細胞因子IL－3［6］。本實驗應用BCR/ABL－BaF3細胞株作為研究對象，應用RNA干擾技術將FAK基因沉默，研究FAK shRNA對白血病生長的影響。體外實驗結果表明FAK shRNA能抑制白血病細胞生長及集落形成。本實驗將BCR/ABL－BaF3白血病細胞經尾靜脈注射到BALB/c小鼠體內，成功建立白血病動物模型。動物體內實驗證實FAK shRNA能抑制白血病生成，延長白血病動物模型的生存時間。我們實驗結果說明FAK shRNA能明顯抑制白血病細胞生長。

FAK在正常細胞或腫瘤細胞的生命活動中發(fā)揮重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK與白血病的進展及預后有關。國外有研究分析60例急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的血液標本，發(fā)現(xiàn)42%白血病細胞高表達 FAK蛋白及 mRNA，46%CD34+白血病細胞表達FAK蛋白［7］。最近有研究也分析36例AML病例，發(fā)現(xiàn)患者腫瘤細胞中FAK蛋白高表達則其預后相對較差，說明FAK是影響白血病患者生存率的重要因素之一［8］。Shahzad 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK shRNA能增強卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性，并通過caspase－3蛋白酶誘導細胞凋亡。最近國內也有學者關注FAK基因在白血病細胞的表達及意義。有學者應用酪氨酸激酶抑制劑處理K562白血病細胞株，發(fā)現(xiàn)隨著化療藥物濃度增加，K562細胞內FAK mRNA表達逐漸降低，提示該化療藥物可能通過降低FAK mRNA表達而抑制白血病細胞增殖［10］。研究結果提示FAK基因可作為白血病治療的新靶點。

FAK在細胞生長中扮演重要角色，有研究表明FAK介導細胞生存的信號轉導通路主要有:(1)PI－3K－PKB－Bad－GSK3。FAK結構中Tyr397位點的磷酸化可激活PI－3K激酶，進而活化第二信使PI(3，4，5)P3 和 PI(3，4)P2，最終活化磷脂蛋白酶PKB。PKB活化后通過滅活一系列細胞凋亡蛋白如Bad、GSK3 等而提供細胞生存信號［11］。(2)Src－p130CAS－Ras－JNK。細胞外基質與FAK介導的生存信號可通過Src使p130CAS磷酸化，激活Ras信號及JNK［12］。(3)阻斷腫瘤抑制因子p53信號。研究發(fā)現(xiàn)FAK的N端能與p53分子N端相結合，兩者相互作用能降低p53分子的轉錄活性，阻斷凋亡蛋白的信號，促使細胞獲得生存信號［13］。有關 FAK shRNA治療白血病的作用機制尚未明確，我們既往研究發(fā)現(xiàn)FAK shRNA能誘導白血病細胞凋亡［5］。本實驗進一步發(fā)現(xiàn)FAK shRNA能明顯降低STAT5蛋白磷酸化水平，并引起caspases－3的活化，提示FAK shRNA作用途徑可能與STAT5及caspases－3有關。BCR/ABL基因是人體細胞第9號染色體ABL原癌基因與第22號染色體BCR基因相互易位形成的融合基因，可引起FAK蛋白激酶持續(xù)性活化［14］。本實驗結果提示通過FAK基因沉默能抑制BCR/ABL基因的成瘤性，具體分子信號通路仍有待深入探討。

綜上所述，F(xiàn)AK shRNA能抑制FAK蛋白表達，體外實驗發(fā)現(xiàn)FAK shRNA抑制白血病細胞生長，動物體內實驗也證實FAK shRNA能抑制白血病生成，為FAK基因沉默治療白血病提供實驗基礎。

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