何梅鳳， 鄧新國，2*， 吳 偉， 高 楊，2

(1．中山大學中山眼科中心;2．中山大學眼科學國家重點實驗室，廣東廣州510060)

川芎嗪是從中藥川芎的根莖中提取的有效成分，具有擴張血管、抗血小板聚集、改善組織微循環(huán)、抗脂質(zhì)過氧化、抗自由基、Ca2+阻滯、抗組織纖維化等藥理作用，臨床應用廣泛［1-2］。近年來，其在眼科疾病的防治也取得了一定的療效，具有較好的應用前景［3-4］。有研究［5］表明，川芎嗪經(jīng)腹腔注射后能進入兔眼組織，但存在眼內(nèi)組織消除快的缺點，而全身用藥的次數(shù)又受患者的依從性和藥物不良反應等因素的影響，從而使其在眼科臨床使用受到一定的影響。因此，將其開發(fā)成眼局部應用劑型具有重要的意義。目前，國內(nèi)外還未見有關(guān)川芎嗪局部滴眼后眼內(nèi)藥代動力學的報道，本研究通過鹽酸川芎嗪局部應用兔眼后，考察其房水藥代動力學情況，為川芎嗪眼局部應用提供理論依據(jù)。

1 試驗材料

1．1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀，包括G1314A紫外檢測器，G1316A柱溫箱，G1329A帶溫控自動進樣器，G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機(美國安捷倫公司);Agilent 1100化學工作站;離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1．2 試藥 鹽酸川芎嗪對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110817-200305);鹽酸川芎嗪原料藥(西安力邦制藥有限公司，批號:061001B);鹽酸川芎嗪滴眼液(自制，5 mL∶25 mg);玻璃酸鈉(山東福瑞達生物化工有限公司，批號:0508111);甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。

1．3 動物 新西蘭白兔27只，健康無眼疾，雌14只，雄13只，體質(zhì)量2．0～2．4 kg，由廣東醫(yī)用動物實驗中心提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 實驗動物分組 將27只新西蘭白兔，隨機分為9組，每組3只(6眼)。

2．2 給藥及樣品采集方法 將家兔固定在兔箱內(nèi)，輕輕拉開眼瞼使與眼球成袋狀，用微量加樣器滴入鹽酸川芎嗪滴眼液50μL，再輕輕放開下眼瞼，使藥物不會溢出。給藥后，分別于 0、2．5、5、15、30、60、120、180、240 min采取耳緣靜脈空氣栓處死家兔，立即抽取房水150μL置1．5 mL離心試管中，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18不銹鋼柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(62 ∶38)，體積流量0．9 mL/min，紫外檢測波長為280 nm，柱溫為20℃，進樣量40μL。

2．4 對照品溶液的配制 精密稱取鹽酸川芎嗪對照品8 mg，以甲醇為溶媒定容于10 mL量瓶，即得質(zhì)量濃度為0．8 mg/mL的對照品貯備液，密封放冰箱備用。對照品工作液在使用前由以上貯備液稀釋制得。

2．5 樣品處理 分別取不同時間組白兔房水各150 μL，解凍后，旋渦振蕩1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液100μL，加入100μL色譜甲醇，旋渦振蕩1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，進樣40μL。

2．6 系統(tǒng)適應性試驗

2．6．1 方法專屬性 在以上色譜條件下，鹽酸川芎嗪的保留時間為6．7 min，與眼組織中內(nèi)源性物質(zhì)及其它雜質(zhì)分離良好。色譜圖見圖1。

圖1 鹽酸川芎嗪色譜圖Fig．1 Chromatogram of ligustrazine hydrochloride

2．6．2 標準曲線制備 精密吸取空白房水適量，與上述對照品貯備液稀釋制得的不同質(zhì)量濃度對照品工作液適量混合，配制成鹽酸川芎嗪質(zhì)量濃度為40、20、10、2、1、0．5、0．25 和 0．025 μg/mL 的空白房水川芎嗪溶液，按2．5項方法進行處理進樣，將峰面積值(A)對濃度值(C)作線性回歸，所得標準曲線為:C=0．009 43A －0．027 08，r=0．999 9，表明鹽酸川芎嗪在質(zhì)量濃度為20～0．012 5μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2．6．3 回收率和精確度試驗 精密稱取鹽酸川芎嗪對照品適量，分別配制 0．25、2．00 和 20．00 μg/mL 3個質(zhì)量濃度的鹽酸川芎嗪空白房水液，按2．5項下操作并進行分析，求得鹽酸川芎嗪在空白房水中的回收率。在同一天和5 d間(每天一批)對以上3個質(zhì)量濃度的鹽酸川芎嗪空白房水液分別處理5批后進樣分析，分析日內(nèi)和日間的RSD。房水中鹽酸川芎嗪低、中、高3種濃度回收率及精密度結(jié)果見表1。

表1 兔眼房水中鹽酸川芎嗪回收率和精密度(n=5)Tab．1 Recovery and accuracy of ligustrazine hydrochloride in the humor aqueous of rabbits(n=5)

2．6．4 穩(wěn)定性考察 精密稱取鹽酸川芎嗪對照品適量，分別配制0．25、2．00 和 20．00 μg/mL 3 個質(zhì)量濃度的鹽酸川芎嗪空白房水液，分別考察樣品于冰箱 －20 ℃存放0、2、4、8、12 d 后，樣品經(jīng)處理放置0、4、8、12、24 h 后鹽酸川芎嗪的穩(wěn)定性。結(jié)果 3 個質(zhì)量濃度的RSD＜8%，表明樣品在12 d內(nèi)冰凍保存穩(wěn)定，處理后24 h內(nèi)進樣分析不影響結(jié)果。

2．7 房水中鹽酸川芎嗪的濃度 兔眼局部滴用鹽酸川芎嗪滴眼液后，川芎嗪能快速進入兔眼房水，5 min達高峰，然后逐漸下降，在4 h其濃度已非常低。具體結(jié)果見圖2。

圖2 兔眼滴用鹽酸川芎嗪滴眼液后房水的藥時曲線Fig．2 Mean concentration-time curves of ligustrazine hydrochloride in aqueous humor of rabbits after topical adm inistration

2．8 房水中的藥代動力學模型擬合及相關(guān)參數(shù)鹽酸川芎嗪滴眼液局部應用后在兔眼房水中的房室模型及藥代動力學參數(shù)采用DSA2．1．1版軟件進行擬合。結(jié)果表明，鹽酸川芎嗪濃度在正常白兔房水中呈二室模型，達峰時間快，峰濃度較高，但消除也較快。具體藥代動力學參數(shù)見表2。

表2 兔眼局部滴用鹽酸川芎嗪后鹽酸川芎嗪在房水中的藥動學參數(shù)( ± s，n=6)Tab．2 The pharmackinetic parameters of ligustrazine hydrochloride in aqueous humor of rabbits after topical adm inistration( ± s，n=6)

表2 兔眼局部滴用鹽酸川芎嗪后鹽酸川芎嗪在房水中的藥動學參數(shù)( ± s，n=6)Tab．2 The pharmackinetic parameters of ligustrazine hydrochloride in aqueous humor of rabbits after topical adm inistration( ± s，n=6)

參數(shù) 參數(shù)值T max/h 0．083 ±0．000 C max/(μg/mL)16．202 ±2．565 t1/2α/h 0．509 ±0．179 t1/2β/h 0．857 ±0．278參數(shù) 參數(shù)值MRT/h 0．682 ±0．048 AUC/(μg·h/mL) 14．584 ±2．950 V/F/L 1．234 ±0．170 CL/(L/h)1．418 ±0．277

3 討論

由于眼內(nèi)容物的容量有限，可供采集的標本量較少，因此，測定眼組織中某藥物成分時，選擇的檢測方法要求有足夠的靈敏度。在含川芎嗪的生物樣本中，選用甲醇-水作為流動相測定血中川芎嗪已有報道，對樣本的處理以往多選用二氯甲烷或三氯甲烷［6-7］，近年也有采用甲醇、甲醇和二氯甲烷混合溶液、乙腈或非那西丁乙腈溶液處理生物樣本后對鹽酸川芎嗪進行測定的報道［5，8-10］。本實驗先將房水樣本經(jīng)高速離心，再經(jīng)甲醇簡單處理后，采用高效液相色譜法測定川芎嗪濃度，比單一離心或甲醇處理樣本沉淀蛋白質(zhì)更完全，雜質(zhì)峰更少，且樣品稀釋比(1∶1)好，日內(nèi)、日間變異小，回收率大于95%。結(jié)果表明，該方法具有特異、靈敏、快速等優(yōu)點，適用于對房水中川芎嗪的測定。

目前，臨床應用的川芎嗪制劑主要是注射劑、片劑及膠囊劑，國內(nèi)外尚未見有川芎嗪眼用制劑的報道。本研究，我們將鹽酸川芎嗪制成滴眼液，并通過鹽酸川芎嗪滴眼液單劑量滴用兔眼后，采用高效液相色譜法測定了不同時間房水中的川芎嗪，考察了其眼內(nèi)吸收和代謝情況。實驗結(jié)果表明，其質(zhì)量濃度在正常白兔房水呈二室模型，川芎嗪局部應用兔眼后，具有較強的眼內(nèi)穿透性，能快速進入兔眼房水，5 min達峰濃度，而消除也較快，4 h其濃度已非常低。此結(jié)果與以往研究報道［5］的川芎嗪經(jīng)腹腔注射后在房水中的藥代動力學特點相比，眼局部用藥后在房水的達峰時間較快，消除速度也稍快。因此，將川芎嗪制成眼局部用緩釋制劑，延長其在眼內(nèi)的滯留時間，是一項值得進一步探討的課題。

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