梁世霞， 余麗梅， 苗加偉， 吳 芹， 劉 杰*

(1．遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室/貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563003;2．遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563003)

六神丸是中國傳統(tǒng)中藥的四大名藥之一，在中國的藥用史長達(dá)300多年，組方中含有蟾酥、雄黃等6味名貴中藥材;對(duì)咽喉腫痛、口舌糜爛、牙痛、流行性腮腺炎等的治療有獨(dú)到的功效［1］，近年來也被用于治療流行性感冒、帶狀皰疹、尋常疣和腫瘤等多種疾?。?］。其組方中的雄黃和蟾酥都是有毒中藥材，大量或長期攝入會(huì)引起中毒［3-4］。六神丸引起的不良反應(yīng)報(bào)道也有不少，不合理用藥可引起患者死亡，尤其是新生兒及嬰幼兒死亡事件時(shí)有發(fā)生。六神丸究竟有多毒?六神丸含雄黃，其毒性是否等同于一般的無機(jī)砷化物?六神丸的毒性是蟾酥還是雄黃引起的?本實(shí)驗(yàn)將六神丸、雄黃和蟾酥的急性毒性與無機(jī)砷進(jìn)行比較，為六神丸的臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1．1 材料 六神丸、雄黃(＞90%As4S4)和蟾酥均購自蘇州雷允上有限公司;砷酸氫二鈉，美國Sigma公司;PCR純化試劑盒，上海華舜生物技術(shù)有限公司批號(hào)2006A;逆轉(zhuǎn)試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司批號(hào)DRR037A;Trizol寶生物工程(大連)有限公司 批號(hào)D91084;SYBR Green熒光染料(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA);硝酸(優(yōu)級(jí)純)批號(hào)T20090902國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所有試劑均分析純等級(jí)。

1．2 動(dòng)物 昆明種成年小鼠購自重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)檢中心，清潔級(jí)，18～22 g，雌雄各半，合格證:NO．0002438，飼養(yǎng)于(22±1)℃，(50±2)%的相對(duì)濕度，日晝12 h交替的動(dòng)物室。

1．3 主要儀器 TU-180紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;多功能梯度PCR儀，型號(hào):22331;冷凍離心機(jī)，型號(hào):5417R;冷凍離心機(jī)，型號(hào):X-15R;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國，型號(hào):Icyclery IQ;Leica QwinV3圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司;消化用電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，型號(hào):101B-2上海電熱儀器總廠;雙道原子熒光光度計(jì)，北京科創(chuàng)海光儀器有限公司，型號(hào):NO．L1d049。

2 方法

2．1 分組及給藥 昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為正常對(duì)照組、六神丸組(200 mg/kg，含雄黃或蟾酥 26．6 mg/kg，40 倍的臨床日用藥量)、雄黃組(30 mg/kg，相當(dāng)于As 21 mg/kg)、蟾酥組(30 mg/kg)、Na2HAsO4·7H2O 組(As5+，44 mg/kg，相當(dāng)于 As10．5 mg/kg)，分別灌胃給予(0．2 mL/10 g)以上各藥物，正常對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。給藥后觀察小鼠的一般狀況，8 h后斷頸處死小鼠取材。

2．2 血清ALT、AST、BUN測定 收集血液離心取血清，自動(dòng)分析儀定量檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，評(píng)估肝、腎功能。

2．3 組織中砷含有量檢測 取肝、腎和心組織，稱質(zhì)量100 ～200 mg，加入5 mL 濃硝酸，170 ℃、2．5 h高溫消化，去離子水定容到25 mL，混勻后取5 mL加入1 mL 5%的硫脲-抗壞血酸混合液，混勻后靜置30 min，原子熒光法檢測組織內(nèi)砷蓄積量。

2．4 病理學(xué)觀察 取同部位肝、腎和心組織，用甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，雙盲法在普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變，取典型照片進(jìn)行病理學(xué)分析。

2．5 MT-2 mRNA檢測 取肝、腎和心組織50～100 mg，加入細(xì)胞裂解液Trizol 1 mL，按照說明書提取、純化總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，凝膠電泳檢測其完整性，用莫洛尼(氏)鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和寡脫氧胸苷酸逆轉(zhuǎn)MT-2 mRNA，其上游引物序列為TGTGCCTCCGATGGATCCT，下游引物序列 GCAGCCCTGGGAGCACTT，用SYBR Green熒光染料進(jìn)行適時(shí)定量PCR擴(kuò)增。用18S做內(nèi)參，通過Ct值比較不同組之間的基因相對(duì)差異性表達(dá)。

3 結(jié)果

3．1 組織砷蓄積 由表1可知相同含砷量的六神丸(200 mg/kg)在肝臟組織的蓄積量為260 ng/g大于雄黃(30 mg/kg)組 83 ng/g，而1/2含砷量的As5+組(44 mg/kg)肝組織砷蓄積卻達(dá)到了3 560 ng/g，是六神丸的14倍。這表明六神丸復(fù)方可促進(jìn)砷的吸收和向肝組織的分布，但其蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+組。

表1 原子熒光法測得肝、腎、心組織中砷蓄積量( ± s，n=6)Tab．1 Arsenic contents in mouse liver，kidney and heart( ± s，n=6)

表1 原子熒光法測得肝、腎、心組織中砷蓄積量( ± s，n=6)Tab．1 Arsenic contents in mouse liver，kidney and heart( ± s，n=6)

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0．05。正常小鼠組織中含有微量(ng)砷，均在正常范圍［5］。

組別 肝砷蓄積/(ng/g)腎砷蓄積/(ng/g)心砷蓄積/(ng/g)正常對(duì)照組六神丸組雄黃組As5+組蟾酥組76±6 261±24*83±7 3561±930*74±8 101±10 188±10*109±7 4 574±1 182*93±5 139±16 161±10 159±19 410±93*131±9

上述給藥量的六神丸在腎臟組織的蓄積量(187 ng/g)略大于雄黃(108 ng/g)，而As5+組肝組織砷蓄積卻達(dá)到了4 574 ng/g，是六神丸的16倍。同樣，六神丸復(fù)方可以促進(jìn)砷的吸收和向腎臟的分布，但其在腎組織的蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+組。

六神丸和雄黃在心肌組織中蓄積很低，As5+組在心肌的蓄積量(410 ng/g)是六神丸的2．5倍，高于雄黃組(159 ng/g)。

3．2 血生化結(jié)果 AST和ALT及BUN是血液中分別反映肝、腎功能的客觀指標(biāo)，如表2顯示，與正常對(duì)照組比，六神丸(200 mg/kg)、雄黃(30 mg/kg)、蟾酥(30 mg/kg)對(duì)血液中ALT、AST、BUN水平幾乎沒有影響，但As5+組明顯升高血液中AST、ALT和BUN水平，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明六神丸、雄黃、蟾酥在上述劑量下對(duì)小鼠的肝腎功能沒有明顯的影響，而As5+卻明顯損傷肝腎功能。

表2 小鼠血清中AST、ALT和BUN水平 ( ± s，n=6)Tab．2 Serum activity of AST，ALT，and BUN level

表2 小鼠血清中AST、ALT和BUN水平 ( ± s，n=6)Tab．2 Serum activity of AST，ALT，and BUN level

注:*表示與正常對(duì)照組比較，P＜0．05。

組別 AST/(U/L) ALT/(U/L) BUN/(mmol/L)正常對(duì)照組274 ±33．8 47．5 ±6．6 10．2 ±0．4六神丸組 306 ±42．5 60 ±6．6 8．6 ±0．4雄黃組 367 ±58．2 76．8 ±6．3* 10．4 ±0．5 As5+組 507 ±118* 149 ±47．7* 22．4 ±4．3*蟾酥組320 ±47．3 75．2 ±6．3 9．7 ±0．8

3．3 病理學(xué)變化HE染色結(jié)果 由圖1可知，六神丸組、蟾酥組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，有少量的炎細(xì)胞侵潤，雄黃損傷略重于六神丸，肝細(xì)胞嗜酸性變，輕微點(diǎn)狀壞死。而As5+組肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞嗜酸性變、壞死，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死及間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞侵潤。

六神丸組、蟾酥組、雄黃組小鼠腎臟皮質(zhì)部腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，近曲小管管腔結(jié)構(gòu)完整，無擴(kuò)張，間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞侵潤。As5+組腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞伴充血腫脹，腎小球球囊腔縮小，近曲小管腫脹，管腔結(jié)構(gòu)消失，有炎性細(xì)胞侵潤，腎小管上皮細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。

六神丸、雄黃對(duì)心肌組織幾乎無損傷，而蟾酥對(duì)心肌組織有輕微損傷，引起心肌細(xì)胞的炎性細(xì)胞侵潤，心肌間質(zhì)充血及點(diǎn)狀壞死，但程度較As5+組為輕，As5+組心肌組織細(xì)胞變性、壞死廣泛，部分心肌細(xì)胞斷裂，心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂。

3．4 金屬硫蛋白相對(duì)表達(dá)量 結(jié)果見表3。與對(duì)照組比，六神丸組幾乎不上調(diào)肝組織中MT-2 mRNA的表達(dá)，蟾酥和雄黃組肝組織中MT-2 mRNA的表達(dá)量上升3～4倍，而As5+組肝臟中MT-2 mRNA的表達(dá)量則上升15倍之多。

圖1 各組小鼠肝、腎、心組織病理學(xué)變化(HE染色，×100)Fig．1 Histopathology of liver(A，B)，kidney(C，D)and heart(E，F(xiàn))arrows indicate necrosis(×100)

六神丸、雄黃和蟾酥組腎組織中MT-2mRNA的表達(dá)無明顯變化，而As5+組腎臟中MT-2 mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的26倍。

六神丸、雄黃組對(duì)心肌組織中MT-2 mRNA的表達(dá)均無影響。蟾酥組MT-2 mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的3倍，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而As5+組心肌組織中MT-2 mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的180倍。此結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果一致，表明蟾酥對(duì)心肌有輕微損傷，其損傷程度遠(yuǎn)小于As5+。

表3 組織金屬硫蛋白M T-2 m RNA的相對(duì)表達(dá)量( ± s，n=6)Tab．3 The relative transcrip t levels ofmetallothionein-2(MT-2)in liver，kidney and heart

表3 組織金屬硫蛋白M T-2 m RNA的相對(duì)表達(dá)量( ± s，n=6)Tab．3 The relative transcrip t levels ofmetallothionein-2(MT-2)in liver，kidney and heart

注:與正常對(duì)照組比較，*P ＜0．05。

組別 肝表達(dá)量 腎表達(dá)量 心表達(dá)量正常對(duì)照組六神丸組雄黃組As5+組蟾酥組100±40 113±81 438±161 1 465±609*333±163 100±46 76±26 79±18 2 558±691*91±23 100±58 98±45 48±25 18 130±6 258*311±79

4 討論

六神丸是中國傳統(tǒng)中藥的四大名藥之一，同藥典中的其他23味中成藥一樣因含有雄黃其安全性受到了質(zhì)疑，又因其含砷量超出國際標(biāo)準(zhǔn)而被國外禁止使用。新生兒及嬰幼兒六神丸急性中毒均為一次口服引起。本實(shí)驗(yàn)以正常小鼠為對(duì)象，觀察了單次口服給藥后小鼠肝、腎和心肌組織內(nèi)砷蓄積量，血液中肝腎功能指標(biāo)的變化，肝、腎、心組織病理學(xué)改變及金屬硫蛋白表達(dá)的變化，以上各個(gè)方面的結(jié)果均證明，六神丸及其組分雄黃、蟾酥毒性遠(yuǎn)小于無機(jī)砷化物As5+。

雄黃又名黃金石、石黃，為硫化物類礦物，主要成分是As4S4，雄黃是國務(wù)院在《醫(yī)療用毒性藥品管理辦法》特別規(guī)定的28種毒性中藥之一［6］。藥典曾兩次降低雄黃的日用量，現(xiàn)為0．05～0．1 g，仍然大大超出國際標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明通過六神丸組方配伍后，雄黃的毒性作用大大減弱［7］，在Beagle犬的毒性研究實(shí)驗(yàn)中證明六神丸全方對(duì)雄黃確實(shí)有減毒作用［8］。連續(xù)給予含雄黃的中藥復(fù)方安宮牛黃丸8 h，其毒性遠(yuǎn)小于砷酸氫二鈉(As5+)和亞砷酸鈉(As3+)［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，六神丸組含砷量與雄黃組相當(dāng)，而其組織砷蓄積量大于雄黃組，表明六神丸可以促進(jìn)砷的吸收和向組織分布，這也許與六神丸的藥理作用有關(guān)。但六神丸對(duì)組織的毒性卻并不大于雄黃，這可能正是中藥復(fù)方的君、臣、佐、使奧妙之所在。同時(shí)，雄黃在肝、腎、心組織砷蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，血生化、病理學(xué)結(jié)果表明，雄黃對(duì)小鼠肝、腎、心的損傷程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，其誘導(dǎo)肝、腎、心組織中的金屬硫蛋白表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，所以雄黃的急性毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，用總含砷量去評(píng)價(jià)雄黃的毒性是不科學(xué)的。

蟾酥為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物，長期過量服用會(huì)導(dǎo)致中毒［3，9］。Beagle 犬一次灌胃六神丸、六神丸去蟾酥和蟾酥，觀察其急性毒性，結(jié)果顯示，六神丸組和蟾酥組都出現(xiàn)了不同程度的心臟毒性，這表明六神丸全方對(duì)蟾酥并沒有解毒作用［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蟾酥對(duì)小鼠心臟毒性大于肝腎組織，可以造成心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和形態(tài)的改變，但六神丸組未見明顯的心臟損傷。本實(shí)驗(yàn)蟾酥用藥量是臨床日用量40倍，這提示，大量蟾酥可致心臟毒性，服用蟾酥一定不能過量，心臟功能不好者要慎用。六神丸的毒性不等于蟾酥的毒性，也不等同于蟾酥和雄黃毒性的簡單相加。

金屬硫蛋白(MT)是一類小的富含巰基的金屬結(jié)合蛋白，其巰基可以螯合大量的金屬離子后將其排出體外。MT可以被砷誘導(dǎo)生成，而MT的誘導(dǎo)產(chǎn)生可能是機(jī)體拮抗砷慢性毒性的一個(gè)細(xì)胞機(jī)制，可能在砷耐受中起適應(yīng)性作用［11］，因此MT可以作為砷暴露的敏感指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)在分子水平上通過real time RT-PCR檢測MT-2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，臨床用藥量40倍的六神丸組、雄黃組、蟾酥組對(duì)肝、腎、心組織中的金屬硫蛋白沒有明顯的誘導(dǎo)作用，而As5+組在肝、腎、心組織中都大量表達(dá)金屬硫蛋白，這再次驗(yàn)證了砷蓄積、血生化和病理學(xué)結(jié)果。

六神丸是耳鼻喉科常備良藥之一，在治療多種疾病時(shí)都取得了良好的療效［1-2］，而長期或大量服用六神丸引起的不良反應(yīng)也時(shí)有發(fā)生，新生兒服用六神丸引起急性中毒大多數(shù)是由于服用過量所致［12-13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予40倍臨床日用藥量的六神丸，肝腎組織均有輕微的炎癥反應(yīng)，組織砷蓄積量也有所增加，這提示六神丸過量可以產(chǎn)生毒性，臨床服用六神丸一定不要過量。雄黃和蟾酥都具有多方面的藥理學(xué)作用，在治療多種疾病時(shí)發(fā)揮著藥理學(xué)效應(yīng)，其在六神丸中所發(fā)揮的藥理學(xué)效應(yīng)及其相關(guān)的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

砷毒性可因砷的價(jià)態(tài)，所處的形態(tài)不同而其毒性也大大不同［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:六神丸對(duì)肝、腎、心組織急性毒性遠(yuǎn)小于As5+單體的毒性。其機(jī)制在毒代動(dòng)力學(xué)上，雄黃在組織的砷蓄積量遠(yuǎn)小于As5+組。在毒效學(xué)方面，雄黃對(duì)炎癥和金屬硫蛋白的表達(dá)的影響遠(yuǎn)小于As5+組。因此，用總含砷量評(píng)價(jià)雄黃和六神丸的毒性是不科學(xué)的。

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