張冬梅,陳 萌,吳愛明,婁利霞,李麗娜,呂晞瀅

活血益氣方由黃芪、黨參、丹參、川芎、赤芍等藥物組成,是以活血益氣法為指導思想而構(gòu)建的經(jīng)驗方。大量研究顯示,本方不僅在臨床觀察中防治心肌梗死后心力衰竭(心衰)有效,而且在多項動物實驗研究中也證實有逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心室重構(gòu)的作用[1,2]。促進梗死邊緣區(qū)血管新生是活血益氣方治療缺血性心臟病的作用機制之一,其促血管新生作用可能與其誘導缺血心肌局部血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達有關(guān)[3]。VEGF165是 VEGF家族中發(fā)揮生物學效應(yīng)的主要成分,是VEGF-A最豐富的異構(gòu)體[4]。因此,為了進一步探討活血益氣方對缺血性心臟病治療性血管生成的作用機制,我們通過構(gòu)建pcDNA3.1-VEGF165重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中,構(gòu)建HUVEC細胞VEGF信號通路激活細胞模型,離體觀察活血益氣方及其拆方藥物血清對VEGF165基因轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌一氧化氮(NO)、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)的影響,以期部分揭示活血益氣方作用的細胞學機制。

1 材料與方法

1.1 HUVEC-2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC-2(Cat No.200t-5n,Cell application)購自北京清源浩生物科技有限公司。

1.2 動物 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,體重250 g～270 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2009-0080。

1.3 儀器 超凈工作臺(北京半導體一廠),二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus GBB16,德國),IMT-2倒置顯微鏡(OLYMPUS,日本),LDZ5-2低速自動平衡離心機(北京雷勃爾),HHW21-420電熱恒溫水浴箱(天津泰斯特),THZ-C恒溫振蕩器(北京太倉),PHS-3B精密PH計(上海雷磁),酶標儀(ClinicBio,美國)。GeneQuant紫外分光光度計(Pharmacia,美國),DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型電泳儀(北京六一廠)。

1.4 藥物和試劑 活血益氣方由黃芪60 g、黨參60 g、丹參10 g、川芎10 g、赤芍10 g等藥物組成。益氣方由黃芪 60 g、黨參60 g等藥物組成;活血方由丹參10 g、川芎10 g、赤芍10 g等藥物組成。所有藥物均采用免煎顆粒,由北京未名天人中藥有限公司生產(chǎn)。常溫干燥保存。

培養(yǎng)基 Medium 200(Cat No.M-200-500,GIBCO),生長因子LSGS(Cat No.S-003-10,GIBCO),購自北京清源浩生物科技有限公司。pcDNA3.1空質(zhì)粒購自Invitrogen life technologies公司,pcDNA3.1-VEGF165質(zhì)粒[Bam HI/sal I fragment of VEGF165 encoding,Region(ORF)in pcDNA3.1 Bam HI/NoT I site]的構(gòu)建及測序鑒定由北京泛基諾科技有限公司完成。TIAN pure Midi Plasmid Kit(dp107-02),由天根生化科技北京有限公司提供。BCA法蛋白定量試劑盒(NO.P1511),RIPA裂解液(NO.P1053),5×loading buffer(NO.B1007),NC硝酸纖維素膜(NO.2110),Super ECL Plus超敏發(fā)光液(NO.P1010),蛋白 Marker(NO.P1100),NO assay kit(E1030),均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。Fugene HD transfection reagent(NO.04709705001,Roche),兔抗人VEGF抗體及羊抗兔IgG,購自武漢博士德生物工程有限公司。人eNOS酶聯(lián)免疫分析試劑盒(NO.HRZ-H0210,R&D公司,進口分裝),購自北京優(yōu)博奧生物科技有限公司。

1.5 藥物血清的制備 參照文獻[5]換算出大鼠等效劑量。按照活血益氣方組 15.86 g/(kg·d),活血方組3.17 g/(kg·d),益氣方組12.68 g/(kg·d)的劑量給正常SD大鼠灌服中藥制劑,每日1次,持續(xù)給藥1周,末次給藥后 1 h,無菌條件下由腹主動脈取血,取血清,56℃滅活 30 min,分裝,-80℃凍存?zhèn)溆?。另選正常大鼠喂以等量生理鹽水,以同樣方法制備生理鹽水藥物血清。

1.6 pcDNA3.1-VEGF165質(zhì)粒的提取和純化 將構(gòu)建的pcDNA3.1-hVEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中,經(jīng)氨芐西林抗性篩選,DNA測序驗證后,大量擴增陽性克隆。用TIAN pure Midi Plasmid Kit按照說明書抽提、純化質(zhì)粒重組體。收集質(zhì)粒溶液后,用Genequant紫外分光光度計測得溶液A 260/A 280,計算質(zhì)粒的濃度和純度。

1.7 pcDNA3.1-VEGF165質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染 Medium 200與LSGS按比例添加。常規(guī)培養(yǎng)HUVEC,至95%融合后,按照2×105/mL的密度種入6孔板,每孔3 m L,培養(yǎng)24 h。根據(jù)Fugene HD說明書操作,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-hVEGF165質(zhì)粒。質(zhì)?！肍ugene HD按照 2∶3(μg/μL)以M edium 200配制,室溫靜置孵育15 min后,加入細胞長至80%～90%融合的6孔板中,37℃,5%CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4 h后,以添加血清的新鮮Medium200-LSGS培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞常規(guī)培養(yǎng)于6孔板中,加入5%活血益氣方及其拆方含藥動物血清、5%生理鹽水藥物血清培養(yǎng)48 h,陰性對照組不加藥物血清,僅加入Medium 200-LSGS培養(yǎng)?？瞻讓φ战MHUVEC既不進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,也不加入藥物血清,僅以Medium 200-LSGS常規(guī)培養(yǎng)。取細胞上清,3 000 r/min離心20 min后,分裝于1.5 mL ep管中,每管500μL,凍存于-80℃冰箱中備用。

1.8 Western blot測定HUVEC細胞VEGF蛋白的表達 以0.01 mol/L PBS輕輕洗滌細胞兩次,每孔加入100μL RIPA裂解液,置冰上裂解20 min后,用干凈的細胞刮刷將細胞刮于孔的一側(cè),然后用移液器將細胞碎片和裂解液移至1.5 m L離心管中,4℃,12 000 r/min離心5 min,取上清。取2μL樣品,按照說明書,采用BCA蛋白定量試劑盒檢測。剩余樣品按比例加入5×loading buffer,100℃煮20 min,分裝后-80℃保存。每個樣品取100μg置于10%SDS-PAGE凝膠上電泳分離,4℃條件下轉(zhuǎn)移至NC膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h。VEGF抗體以封閉液按照1∶1 000的比例稀釋,與NC膜一起封閉在雜交袋中4℃旋轉(zhuǎn)過夜后,與1∶6 000比例稀釋的羊抗兔IgG,室溫孵育1 h。用SuperECL Plus超敏發(fā)光液按試劑說明要求顯影、曝光。用 Quantity one分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin(1∶2 000)的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果即為樣品中VEGF蛋白相對表達量。

1.9 重氮反應(yīng)法(Griss法)測定HUVEC細胞NO的分泌 取100 mmol/L NaNO2標準品8μL,加入992μL蒸餾水中,得到1 000μL的800μmol/L標準品。從800μmol/L管取出200μL加入200μL蒸餾水的400μmol/L管,然后依次取樣用蒸餾水倍比稀釋,得到 200 μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.13μmol/L、1.56μmol/L 管。最后設(shè)置不加標準品的零濃度管。取50μL標準品或細胞上清樣品,加入96孔板中。每孔加入50μL Griess R1,室溫避光放置5 min。然后,每孔加入50μL Griess R2,充分混勻,室溫避光放置5 min,30 min內(nèi),在492 nm測定吸光度。以平均吸光度OD值為X軸,標準品濃度為Y軸,用Excel作圖并得到標準曲線公式。將樣品OD值代入公式計算NO濃度。

1.10 ELISA法測定HUVEC細胞eNOS的分泌 按照說明書配制標準品,設(shè)空白對照孔,標準品孔 36 U/L、24 U/L、12 U/L、6 U/L、3 U/L,每孔 50μL。待測樣品孔中,每孔先加入40μL樣品稀釋液,然后再加入待測細胞上清樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣時將樣品加于酶標孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30 min。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后,在餐巾紙上扣干。重復(fù)5次。每孔加入酶標試劑50μL,空白孔除外。用封板膜封板后37℃溫育30 min。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30 s后,在餐巾紙上扣干。重復(fù)5次。每孔先加入顯色劑A 50μL,再加入顯色劑B 50μL,輕輕振蕩混勻,37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50μL,終止反應(yīng)時孔中藍色立即轉(zhuǎn)為黃色。以空白空調(diào)零,450 nm波長,15 min內(nèi)測定每孔OD值。根據(jù)標準曲線計算相應(yīng)樣品濃度,并乘以稀釋倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 pcDNA3.1-VEGF質(zhì)粒的提取和純化 所提取的pcDNA3.1-VEGF165質(zhì)粒 A260/A 280在1.7～1.8之間,濃度約為0.7μg/μL。

2.2 含藥血清對轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞VEGF蛋白表達的影響陰性對照組、藥物血清各組與空白對照組比較,均可促進HUVEC細胞表達VEGF蛋白(P＜0.01)?；钛鏆夥剿幬镅褰M、活血方藥物血清組、益氣方藥物血清組與陰性對照組比較,其VEGF蛋白表達雖高于陰性對照組,但僅活血益氣組與陰性對照組比較有統(tǒng)計學意義?；钛浇M、益氣方組、生理鹽水組VEGF蛋白表達低于活血益氣方組,差異有統(tǒng)計學意義。詳見圖 1、圖2。

2.3 含藥血清對轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞分泌NO的影響 各藥物血清組、陰性對照組與空白對照組比較,能促進HUVEC細胞分泌 NO(P＜0.05或P＜0.01)?；钛鏆馑幬镅褰M、活血藥物血清組、益氣藥物血清組三者比較,差異無統(tǒng)計學意義。詳見表1。

表1 含藥血清對轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞分泌NO的影響( ±s)

表1 含藥血清對轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞分泌NO的影響( ±s)

組別 n NO(μmol/L)空白對照組 6 93.86±37.28陰性對照組 6 227.50±68.001)5%活血益氣藥物血清組 6 372.26±71.821)3)5%活血藥物血清組 6 338.22±92.871)2)5%益氣藥物血清組 6 353.91±26.131)3)5%生理鹽水藥物血清組 6 270.25±43.941)4)與空白對照組比較,1)P＜0.01;與陰性對照組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01;與活血益氣藥物血清組比較,4)P＜0.01

2.4 藥物血清對轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞分泌eNOS的影響 陰性對照組、活血益氣藥物血清組、活血藥物血清組、益氣藥物血清組、生理鹽水藥物血清組,其HUVEC細胞分泌的eNOS含量均高于空白對照組(P＜0.01)。各藥物血清組中,僅活血益氣藥物血清組eNOS含量高于陰性對照組(P＜0.01)。活血藥物血清組、益氣藥物血清組eNOS含量低于活血益氣藥物血清組(P＜0.01)。詳見表2。

表2 藥物血清對轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞分泌eNOS的影響( ±s)

表2 藥物血清對轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞分泌eNOS的影響( ±s)

組別 n eNOS(U/L)空白對照組 6 52.05±3.69陰性對照組 6 74.69±5.791)5%活血益氣藥物血清組 6 84.98±3.361)2)5%活血藥物血清組 6 73.24±5.841)3)5%益氣藥物血清組 6 72.53±4.551)3)5%生理鹽水藥物血清組 6 68.32±6.461)與空白對照組比較,1)P＜0.01;與陰性對照組比較,2)P＜0.01;與活血益氣藥物血清組比較,3)P＜0.01

3 討 論

VEGF是一種特異性的與血管生長有關(guān)的生長因子,在血管新生的起始階段及其后的血管形成、穩(wěn)定過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。前期實驗結(jié)果顯示,活血益氣方可以誘導缺血心肌局部VEGF表達,促進梗死邊緣區(qū)血管新生[3],但其具體作用機制不明。

VEGF廣泛分布在人體各組織的細胞漿中,主要在血管內(nèi)皮細胞中表達。血管內(nèi)皮細胞既是血管形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),也是VEGF作用的靶細胞。由于內(nèi)皮細胞自身VEGF表達水平較低,無法形成有效濃度。因此,本實驗通過構(gòu)建 pcDNA3.1-VEGF165重組質(zhì)粒,外源性轉(zhuǎn)染VEGF165基因,使之在內(nèi)皮細胞中高表達、高分泌。在此基礎(chǔ)上觀察活血益氣方藥物血清對轉(zhuǎn)染VEGF165基因的HUVEC細胞的影響,探討活血益氣方治療性血管新生的作用機制。實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后的HUVEC細胞中VEGF蛋白的表達明顯高于空白對照組,上清液中NO和eNOS的分泌也明顯增多。表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功,轉(zhuǎn)基因后HUVEC的NO、eNOS分泌能力增強。

NO由血管內(nèi)皮細胞釋放,不僅可以單獨誘導內(nèi)皮細胞的遷移和增殖,蛋白酶的釋放以及增加血管通透性有關(guān)[7],而且調(diào)節(jié)各種血管生成因子而影響血管生成[8],促毛細血管的管腔形成[9]。也是血管生成必需的調(diào)節(jié)因子。

研究顯示,NO在VEGF信號活動中起著一定的作用,尤其是對VEGF的促內(nèi)皮細胞增殖及遷移作用[10]。NO不僅可通過低氧誘導因子-1及其DNA黏結(jié)活性的增強來誘導VEGF基因轉(zhuǎn)錄,進而上調(diào)VEGF的表達[11];還可通過激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶,調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的cGMP水平而發(fā)揮上調(diào)VEGF表達的作用[12]。而VEGF對血管通透性的影響是又通過促進血管內(nèi)皮細胞分泌NO和前列環(huán)素來發(fā)揮生物效應(yīng)[13],增強內(nèi)皮完整性,抑制血管平滑肌細胞增殖,增加內(nèi)皮抗血栓等血管保護作用。

eNOS是調(diào)節(jié)NO生成的關(guān)鍵酶。內(nèi)皮細胞中,在Ca2+和熱休克蛋白的介導下,VEGF通過 PI3激酶/Akt信號通路使eNOS磷酸化,激活eNOS[14],促進NO生成,調(diào)節(jié)血管的通透性和緊張性以及血管新生。eNOS的表達增加有利于冠脈側(cè)支循環(huán)的生成[15]。

本實驗結(jié)果顯示,活血益氣方不僅可以促進轉(zhuǎn)染后HUVEC表達VEGF蛋白,還可以促進其分泌NO及eNOS。提示,活血益氣方能通過促進直接促進NO的分泌,或通過促進eNOS分泌,催化生成NO,來參與VEGF的血管新生過程,對缺血心肌的血管新生實現(xiàn)調(diào)節(jié)。其中,活血方和益氣方單用均可以促進轉(zhuǎn)染后HUVEC細胞分泌NO,但對eNOS的分泌未見明顯影響,其具體作用機還有待進一步研究。

[1] 王碩仁,趙明鏡.活血、益氣方藥對心肌梗塞后心力衰竭大鼠血流動力學的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2001,24(7):37-39.

[2] 王振濤,王碩仁,趙明鏡.活血和益氣方藥對心肌梗死后左心衰大鼠左心室重構(gòu)影響的比較研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,22(5):376-378.

[3] 張冬梅,吳愛明,婁利霞,等.活血益氣方對心梗后大鼠缺血心肌血管新生及 VEGF表達的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2010,37(8):1602-1604.

[4] Sugihara T,Wadhwa R,Kaul SC,et al.A novel alternatively spliced form of murine vascular endothelial growth factor VEGF165[J].J Biol Chem,1998,273(5):3033-3038.

[5] 徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:202-204.

[6] Ferrara N.VEGF and the quest for tumor angiogenesis factors[J].Nat Rev Cancer,2002,2(10):795.

[7] Dulak J,Jozkowicz A.Nitric oxide and angiogenic activity of endothelial cells director VEGF dependem effect[J].Cardiovases,2002,56:487-488.

[8] Dan G,Duda DF,Rakesh KJ.Role of eNOS in neovascularization:NO for endothelial progenitor cells[J].Trends M ol Med,2004,10(4):143-145.

[9] 周國偉,張建軍.促血管新生治療的機制與應(yīng)用國外醫(yī)學[J].國外醫(yī)學:血管疾病分冊,2000,27(3):90-93.

[10] 關(guān)勤,劉志勇.分子搭橋技術(shù)研究進展[J].東南大學學報(醫(yī)學版),2006,25(3):212-224.

[11] Sandau KB,Fandrey J,Brune B.Accumulation of HIF-1 aunde the influence of nitric oxide[J].Blood,2001,97:1009-1015.

[12] Jenkins DC,Charles IG Thomsen LL,et al.Role of nitric oxidein ttnnor growth[J].Proc Nat I Acad Sci USA,1995,92:4392-4396.

[13] Oh SJ,Jeltsch MM,Birkenhager R,etal.VEGF and VEGF-Capecific induction of angiogenesis and lymphangiogenesis in the differentiated avianchorioallant oicm-embrane[J].Develop Biol,1997,188:96.

[14] Govers R,Rabelink TJ.Cellluar regulation of endothelial nitric oxide synthase[J].Am J Phy siol Renal Physiol,2001,280:F193-F206.

[15] Cai Weijun,Elisabeth Kocsis,Luo Xuegang,et al.Expression of endothelial nitric oxide synthasein the vascularrwall during arteriogenesis[J].Mol Cell Biochem,2004,264:193-200.