李玉

近年來(lái)，全球結(jié)核病呈現(xiàn)死灰復(fù)燃的趨勢(shì)，其主要原因是耐藥(DR-TB)和耐多藥(MDR-TB)結(jié)核病的廣泛分布和迅速傳播。作為一線抗結(jié)核藥物，INH和RFP結(jié)核病的預(yù)防、治療方面起著重要作用。但由于單藥化療和不規(guī)則化療，其耐藥情況越來(lái)越嚴(yán)重。有研究表明結(jié)核分桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生與過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān);而利福平耐藥則與RNA聚合酶的p亞基的編碼基因rpoB突變有關(guān)。我們?cè)谟肞CR-SSCP方法單獨(dú)檢測(cè)KatG和rpoB基因突變時(shí)，發(fā)現(xiàn)在非變性聚丙烯酰胺凝膠中，這兩種基因的遷移率不同，且差異很大。因此，我們?cè)谝粋€(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增KatG和rpoB基因。再根據(jù)其SSCP圖譜進(jìn)行分析，這樣就可以同時(shí)檢測(cè)異煙肼和利福平耐藥性。我們采用PCRSSCP銀染法直接檢測(cè)臨床分離株和臨床痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌rpoB基因和KatG基因突變，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 107株臨床分離株和39例肺結(jié)核病患者涂陽(yáng)痰標(biāo)本均來(lái)自吉林市結(jié)核病防治研究所。107株臨床分離株按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)為結(jié)核分支桿菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐 SM。65例肺結(jié)核病患者涂陽(yáng)痰標(biāo)本根據(jù)臨床癥狀、涂片結(jié)果、胸部X線和培養(yǎng)結(jié)果確診，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。

1.2 引物序列為 rPOBl 5'CGGATGACCACCCAGGAC，rPOB2 5'GGTTTCGATCGGGCACAT，

KatGl 5'GCGATCACTACCGTGATCACA，

KatG2 5'GTCAGGGCGTCAAGTCGACTG

1.3 方法

1.3.1 dNA的提取 用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取標(biāo)本中DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 采用25 μl反應(yīng)體系，4xdNTPs終濃度為0.2 mmol/L，引物終濃度為0.2 μmol/L，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性1 min，61℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1 min，循環(huán) 30 次，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測(cè)rPOB出現(xiàn)258bp條帶、KatG出現(xiàn)282bp條帶即為擴(kuò)增陽(yáng)性。

1.3.3 SSCP銀染 PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行SSCP檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物加等量甲酰胺變性液95℃變性10 min，立即冰浴5 min，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，條件為6℃/100V電壓，電泳約2～3 h，電泳結(jié)束后，取凝膠板經(jīng)硝酸銀染色，觀察結(jié)果并照相。

2 結(jié)果

2.1 61株結(jié)核分支桿菌臨床分離株中，26株藥物敏感株中，各有1株KatG基因和rpoB基因發(fā)生突變。35株同時(shí)耐異煙肼和利福平分離株中，有22株有KatG基因突變，突變率62.9%。同時(shí)有31株有 rpoB基因發(fā)生突變，突變率為88.6%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 異煙肼和利福平耐藥與KatG和rpoB基因突變結(jié)果

2.2 用PCR-SSCP技術(shù)分析對(duì)39例同時(shí)耐INH和耐RFP肺結(jié)核病患者的痰標(biāo)本和24例非結(jié)核性肺部疾病組痰標(biāo)本進(jìn)行rpoB和KatG基因突變的檢測(cè)。以結(jié)核分支桿菌H37RV為對(duì)照，39例耐RFP痰標(biāo)本中31例PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，其中25例SSCP圖譜與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株有差異，rpoB突變率為64.1%。耐INH肺結(jié)核病患者的痰標(biāo)本有28例擴(kuò)增陽(yáng)性，17例SSCP圖譜與H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株有差異，突變率為43.5%。24例非結(jié)核病患者的痰標(biāo)本rpoB基因和KatG基因PCR擴(kuò)增均為陰性。

3 討論

目前，結(jié)核分支桿菌耐藥性測(cè)定仍多采用絕對(duì)濃度法、比例法等經(jīng)典方法。但由于結(jié)核分支桿菌生長(zhǎng)緩慢，而耐藥結(jié)核分支桿菌生長(zhǎng)更為緩慢，其耐藥性測(cè)定需6～8周甚至更長(zhǎng)，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展已研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生與過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān);而利福平耐藥則與RNA聚合酶的p亞基的編碼基因rpoB突變有關(guān)PCR-SSCP是一種檢測(cè)基因突變簡(jiǎn)便、快速的方法。我們?cè)谝粋€(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增KatG和rpoB基因。再根據(jù)其SSCP圖譜進(jìn)行分析，這樣就可以同時(shí)檢測(cè)異煙肼和利福平耐藥性，結(jié)核分支桿菌臨床分離株rpoB基因和KatG基因突變，陽(yáng)性率分別為88.6%、62.9%，表明結(jié)核分支桿菌異煙肼耐藥與過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因KatG有關(guān)，KatG基因在INH耐藥中起主導(dǎo)作用。但有一部分耐INH株未檢測(cè)到KatG缺失或突變，提示某些菌株的耐INH形成可能與KatG無(wú)關(guān)。INH耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)表明結(jié)核分支桿菌耐利福平與RNA聚合酶的p亞基的編碼基因rPOB有關(guān)，rPOB突變已成為結(jié)核分支桿菌耐RFP的主要遺傳指標(biāo)。我們用此方法直接檢測(cè)結(jié)核病患者痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌rpoB基因和KatG基因突變，陽(yáng)性率分別為64.1%、43.5%。rpoB基因和KatG基因突變低于臨床分離株。這可能與痰標(biāo)本中雜DNA較多，rpoB為單拷貝，同時(shí)痰標(biāo)本的處理和靶DNA濃度對(duì)PCR擴(kuò)增也有直接影響。本文的結(jié)果表明，PCR-SSCP方法具有快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異性高的特點(diǎn)，可在2 d內(nèi)出結(jié)果，并能直接用于臨床結(jié)核病患者痰標(biāo)本結(jié)核分支桿菌耐藥性的檢測(cè)。從而彌補(bǔ)了常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)的不足，有望成為臨床耐藥性測(cè)定的重要手段之一。