吳曉薇 ，徐成剛 ，馬保華 ，江經(jīng)緯 ，葉賀佳 ，區(qū)燕宜 ，徐小芹 ，廖 明

（1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642；2.廣東檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623；3.廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東廣州 510642；4.南海出入境檢驗檢疫局，廣東佛山 528200）

單增李斯特菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，其感染過程包括內(nèi)化、逃避液泡、吞噬、肌動纖維聚集和細胞傳播等階段，與各個階段有關(guān)的毒力因子分別是InlA、hly、actA和plcB[7]。Hly基因是致病性李斯特氏菌重要的的毒力基因，hly基因編碼形成李斯特菌溶血素O（Listeriolysin O，LLO）。目前的研究表明，LLO是一個多功能毒力因子，能引起宿主細胞多種反應，如細胞增殖、黏膜細胞外滲作用、巨噬細胞中細胞因子的表達、樹突狀細胞的凋亡、磷脂代謝及引起機體產(chǎn)生免疫反應等等[8-10]。LLO 是一種穿孔毒素，能損傷紅細胞、巨噬細胞、裂解溶酶體膜和吞噬體膜，使細菌能夠逃離噬菌體，從而逃避吞噬體中殺菌物質(zhì)的殺滅，進入胞漿后在胞漿中復制。溶解素是細菌在胞液內(nèi)繁殖的先決條件，其缺失將使細菌毒力全部喪失。不產(chǎn)生LLO的突變株雖可在非吞噬細胞的胞液中生存一段時間，但卻不能繁殖，并因無法逃逸吞噬體而不能感染其他細胞。單增李斯特菌感染鼠脾臟和骨髓的樹突狀細胞后可導致細胞的凋亡；不產(chǎn)生LLO的李斯特菌突變體不能誘導細胞的凋亡，而提純的LLO則可引起這種程序性控制的細胞死亡[8]。溶解素還在感染細胞內(nèi)誘導信號傳導和定向免疫應答中發(fā)揮重要作用[7]，它能夠促進MHC-I類分子限制性免疫應答，增強保護性抗原的免疫作用[11]。由于LLO 所具有的獨特生物學特性，已被用于構(gòu)建各種減毒疫苗或核酸疫苗。LLO還可能成為一種新型的純化蛋白抗原、脂質(zhì)體、減毒菌株和DNA疫苗的遞送工具[12]。

本研究旨在克隆和表達單增李斯特菌的Hly基因，探索大量制備溶解素蛋白的方法，為進一步研制基于溶解素蛋白的診斷抗原和特異性單克隆抗體，開展LM的致病與免疫機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、酶及主要試劑

單增李斯特菌標準菌株LM-C53005購自中國藥品生物制品監(jiān)察所；菌株C53005為中國藥品生物制品檢定所購買，由華南農(nóng)業(yè)大學禽病研究室保存；克隆載體質(zhì)粒pMD18-T為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；大腸桿菌表達載體質(zhì)粒pET-28a、克隆菌DH5α 和 E.coli BL21（DE3）為 Novagen公司產(chǎn)品；Taq酶、各限制性內(nèi)切酶及其他工具酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I為OMEGA公司產(chǎn)品；丙烯酰胺（Acrylamide）、N-N'-亞甲叉雙丙烯酰胺（Bisacrylamide）和瓊脂粉為廣州展晨生物技術(shù)公司產(chǎn)品；TEMED、過硫酸銨和IPTG為華美生物工程公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG為Sigma公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；兔抗單增李斯特菌血清由華南農(nóng)業(yè)大學禽病研究室制備提供。

1.2 引物設(shè)計與合成

參考GenBank收錄的單增李斯特菌Hly基因序列，使用 DNAstar（5.07版）和 Primer Premier（5.0版）軟件進行分析，針對Hly基因的開放閱讀框架（ORF）中不含信號肽編碼序列的區(qū)域設(shè)計一對引物Hly1和Hly2，并分別在引物的5'端引入限制性內(nèi)切酶BamHI和Xhol I的識別位點（下劃線表示）。預期擴增產(chǎn)物跨幅為1515 bp。

Hly1：5'－GGATCCGATGCATCTGCATTCAAT AAAGA－3'，

Hly2：5'－GCGCCTCGAGTTATTCGATTGGAT TATCTAC－3'

引物送上海生物工程有限公司合成，用DEPC處理過的去離子水稀釋為25 pmol/μL備用。

1.3 菌株DNA的提取

參照上海生工生物工程公司細菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書進行。將菌株進行增菌培養(yǎng)，達到約109CFU/mL，10000 r/min離心1 min，去掉培養(yǎng)液。加入200 μL有溶菌酶的TE溶液，用移液器槍頭混勻。在室溫下酶解 8 min。加入 400 μL的Digestion Buffer，混勻；加入 3 μL 蛋白酶 K，混勻。在55℃的水浴保溫5 min。加入260 μL無水乙醇，混勻，全部轉(zhuǎn)移到套放于2 mL集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，8000 r/min離心1 min，棄去濾液，UNIQ-10柱用洗脫緩沖液洗滌三次；最后用40 μL洗脫緩沖液洗脫核酸，放置－20℃保存。

當t>x(0)/D0(x(0) m1(2D0t)-2β,則存在T2=max(T1,x(0)/D0),當t>T2時,有E(a)>m2t-2β,其中m2=m1(2D0)-2β。另外，因為a(t)<1,有a2(t)

1.4 Hly基因片段的擴增

以提取LM DNA作為模板，用引物Hly1和Hly2進行PCR擴增，PCR反應條件為：94℃4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán) 30次；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后用小量凝膠回收試劑盒進行純化回收。

1.5 Hly基因的克隆與序列測定

參照pMD18-T載體的使用說明進行，將純化的Hly基因PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a感受態(tài)細胞中，挑取白色菌落，用小量質(zhì)粒提取試劑盒質(zhì)粒DNA，陽性質(zhì)粒命名為pMD18-T-sHly，對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，酶切鑒定及測序。所測序列與GenBank收錄的單增李斯特菌Hly基因序列進行BLAST比對。

1.6 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

用BamHI和XholI分別雙酶切重組表達質(zhì)粒pMD18-T-sHly和pET-28a載體，產(chǎn)生相匹配的黏性末端，然后回收目的片段和載體片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-sHly。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞后，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，對重組質(zhì)粒進行PCR及酶切鑒定。

1.7 Hly基因表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將轉(zhuǎn)入pET-28a-Hly和pET-28a空載體的大腸桿菌BL21（DE3）分別接種于LB培養(yǎng)液后，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約等于0.5時，無菌條件下取1 mL菌液作為陰性對照。然后向剩余的培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，無菌條件下取1 mL菌液樣本，10000 r/min離心1 min，取沉淀按照汪家政（2006）[13]的報道進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.8 表達產(chǎn)物的純化

將攜帶表達質(zhì)粒pET-28a-Hly的大腸桿菌BL21（DE3）接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約等于0.5時，用1 mmol/L IPTG誘導6 h，將菌體冷凍離心后棄上清，并重懸于細菌裂解緩沖液中超聲裂解，表達產(chǎn)物作SDS-PAGE分析。12000 r/min離心后收集沉淀重懸于結(jié)合緩沖液中冰浴1 h，過Histrap Ni2+柱（Pharmacia），收集用洗脫緩沖液洗脫下的重組蛋白。

1.9 純化蛋白的Western Blot分析

表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以兔抗單增李斯特菌血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP標記抗體為二抗，進行Western Blot檢測。

1.10 表達產(chǎn)物的可溶性分析

將1.4獲得的攜帶表達質(zhì)粒pET-28a-Hly的重組菌經(jīng)IPTG誘導后，取100 mL培養(yǎng)液，4℃8000 r/min離心15 min，棄上清液；沉淀物用10 mL結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH7.6，20 mmol/L咪唑，0.5 mmol/LNaCl）重懸；超聲裂解（60 W，2 min/次）10 min；將裂解物于4℃8000 r/min離心15 min，分別取適量上清和沉淀物按照1.7、1.9的方法進行SDSPAGE和Western Blot檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hly基因PCR擴增結(jié)果

用引物Hly1/Hly2進行PCR擴增可得到約1500 bp特異性條帶，與預期大小相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-sHly的PCR檢測、酶切鑒定及序列測定

將Hly基因PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接（圖2）。對重組質(zhì)粒進行PCR及酶切鑒定（圖3），并進行序列測定。

2.3 重組原核表達質(zhì)粒的酶切鑒定、PCR檢測及序列測定

用BamHI和XholI分別雙酶切pMD18-T-sHly和pET-28a，經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-sHly。對重組質(zhì)粒進行PCR及酶切鑒定。重組質(zhì)粒pET-28a-Hly用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切可以得到2690 bp左右的載體條帶和1590 bp左右的目的條帶，其大小分別與表達載體質(zhì)粒pET-28a及sHly基因PCR產(chǎn)物的大小一致（圖4、5）。

2.4 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

如圖6所示，攜帶表達質(zhì)粒pET-28a-Hly的大腸桿菌 BL21（DE3）經(jīng) IPTG（1mmol/L）誘導后，在 65 kU處形成一條特異的條帶。

2.5 表達產(chǎn)物的Western-blotting鑒定

經(jīng)Western-blotting鑒定可以得知，誘導表達產(chǎn)物可被兔抗LM陽性血清特異識別，如圖7所示。表明單增李斯特菌的Hly基因在大腸桿菌BL21（DE3）中得到正確表達。

3 討論與結(jié)論

本實驗根據(jù) GeneBank發(fā)表的LM的Hly全基因的末端保守序列設(shè)計游引物，采用 PCR方法擴增出標準株C53005溶血素基因，將其克隆到pMD18-T載體中，篩選帶有插入片段的陽性質(zhì)粒。經(jīng)酶切和PCR鑒定，然后進行測序。結(jié)果顯示，標準株C53005株Hly基因全長1590 bp，含有完整的開放閱讀框架，編碼529個氨基酸。其核苷酸序列與報道的EF183456和EQ8447148序列同源性分別為97.0%和99.9%，將其推導的氨基酸序列與報道的EF183456和EQ8447148序列推導的氨基酸序列進行同源性分別為98.0%和99.8%。

本研究以LM標準菌株LM-C53005為材料，克隆了不含信號肽編碼區(qū)域的HlyA基因ORF部分，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-Hly。成功的構(gòu)建表達質(zhì)粒后，誘導表達條件就直接影響實驗的結(jié)果。誘導表達條件（如表達菌株、IPTG誘導濃度、大腸桿菌被誘導時所處的狀態(tài)、誘導時間長短等）對于蛋白質(zhì)的原核表達非常重要，本實驗摸索了培養(yǎng)液中卡那霉素最佳濃度、培養(yǎng)液中的pH值、培養(yǎng)溫度、誘導前的菌液狀態(tài)、IPTG濃度等，結(jié)果證實：37℃培養(yǎng)，IPTG的終濃度1.0 mmol/L，誘導前的菌液OD600約為0.6，誘導時間約為5 h即可以得到較大表達蛋白的量。構(gòu)建重組表達質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導成功表達HlyA基因。經(jīng)Western-blotting鑒定，該蛋白具有良好的免疫學活性。

Hly基因編碼529個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為58 kU。由計算得知，Hly基因表達的融合蛋白理論值應約為65 kU（表達載體pET-28a（+）的下游含有6個組氨酸（6×His）的純化標簽，重組蛋白融合著此6個組氨酸大小為6 kU）。SDS－PAGE分析結(jié)果表明：IPTG誘導后重組菌pET-sHly產(chǎn)生一條約60 kU的蛋白條。在 Western-blotting實驗中用一抗是由本實驗是自制的，采用LM的滅活苗三次免疫兔制備的多克隆抗體。經(jīng)Western-blotting分析表明，表達的約60 kU重組蛋白處與LM全菌體免疫動物制備的多克隆抗體發(fā)生特異性反應，表明此重組融合蛋白與天然的LM溶血素蛋白一樣都具有良好的抗原反應性。同時純化后的Hly蛋白經(jīng)Western-blotting分析表明，表達的重組蛋白帶具有正常的反應原性。這說明重組蛋白可作為良好診斷抗原，也為單核細胞增生性李斯特菌快速診斷方法的建立提供了條件，為今后研制分子診斷試劑提供了科學的理論依據(jù)。另外，一抗、二抗?jié)舛燃胺磻獥l件也會直接影響Western-blotting特異蛋白帶出現(xiàn)。本實驗通過用Dot-ELISA的方法進行一抗、二抗?jié)舛鹊拿鞯牡玫揭豢節(jié)舛?:50，二抗?jié)舛葹?:1000。由于LM溶解素蛋白在單核細胞增生性李斯特菌的致病和免疫方面也起著重要的作用，LLO蛋白的原核表達及其大量制備方法的探討也為進一步開展LM的致病機理與免疫機理的研究奠定了基礎(chǔ)。

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