鐘煒祥 陳銘伍 冼磊 李滿紅

K-ras基因是肺“啟動”癌變的關(guān)鍵基因之一[1]。現(xiàn)已證實(shí)K-ras基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展甚至是預(yù)后均有著密切的關(guān)系。流行病學(xué)研究[2]表明肺癌的發(fā)病具有地域分布與種族差異。目前國內(nèi)各地關(guān)于K-ras基因點(diǎn)突變與肺癌的研究不少，但針對廣西地區(qū)的罕見。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（polymerase chain reactionsingle-strand conformation polymorphism, PCR-SSCP）分析法與PCR-DNA序列分析法聯(lián)合檢測非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）中K-ras基因密碼子12、13及61的點(diǎn)突變，旨在探討K-ras基因突變與廣西地區(qū)NSCLC的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科2007年9月-2010年5月手術(shù)切除的105例新鮮NSCLC標(biāo)本，其中男性69例（65.7%），女性36例（34.3%）；漢族77例（73.3%），壯族24例（22.9%），瑤族2例（1.9%），毛南族2例（1.9%）；年齡范圍24歲-84歲，中位年齡為55歲；無吸煙史57例（54.3%），有吸煙史48例（45.7%）。所有病例均由術(shù)后組織病理學(xué)診斷證實(shí)。按肺腫瘤分類2004（WHO）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型，鱗癌23例（21.9%），腺癌69例（65.7%），其中細(xì)支氣管肺泡癌15例（14.3%）；腺鱗癌6例（5.7%）；其它類型7例（6.7%），包括大細(xì)胞癌4例（3.8%），不典型類癌1例（1.0%），粘液表皮樣癌2例（1.9%）。按國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)（1997）進(jìn)行臨床分期， I期、II期58例（55.2%），III期、IV期47例（44.8%）。腫瘤細(xì)胞分化程度好（分化級別為I+I-II+II級）71例（67.6%），分化程度差（分化級別為II-III+III+IV級）34例（32.4%）。病理證實(shí)無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例（60.0%），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例（40.0%）。所有患者均為初治，術(shù)前未行放、化療或靶向治療。同時取其中30例距癌灶邊緣5 cm以外并經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)無癌細(xì)胞浸潤的正常肺組織做對照，其中男性23例（76.7%），女性7例（23.3%），年齡范圍39歲-74歲，中位年齡為52歲。

1.1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 各引物序列參考文獻(xiàn)[3]，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及純度 應(yīng)用DNA提取試劑盒（離心柱型）提取組織中DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)作DNA純度檢測。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為50 μL，包括：雙蒸水（double distilled water, ddH2O）21.0 μL、引物上、下游（10 μmol/L）各1.0 μL、模板DNA 2.0 μL及2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL；反應(yīng)條件：95 °C 3 min，95 °C 30 s、退火溫度（annealing temperature, Ta）30 s、72 °C 45 s進(jìn)行X個循環(huán)（其中，K-ras-exon 2的Ta為54.5 °C，X為30；K-ras-exon 3的Ta為56.5 °C，X為35），72 °C 5 min。

1.2.3 SSCP分析 取2 μL PCR產(chǎn)物與2 μL變性上樣液（98%去離子甲酰胺、10 mmol/L乙二胺四乙酸、0.025%溴酚藍(lán)及0.025%二甲苯氰）混勻，PCR儀中98 °C變性10 min后立即置于冰上，5 min-10 min 后取2.5 μL上樣，在12%的聚丙烯酰胺凝膠（Polyacrylamide gel, PAG）[其總體積為50 mL，配方：ddH2O 19.7 mL、30%丙烯酰胺混合液（丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺為29:1）20 mL、5×TBE 10 mL、10%過硫酸銨350 μL及四甲基乙二胺33 μL]中180 V（即10 v/cm）電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)接近凝膠下緣（一般為5.5 h-6.0 h）時取下凝膠，采用銀染法染色：10%乙醇固定5 min；1%硝酸氧化3 min，ddH2O淋洗1 min；0.2%硝酸銀染色25 min-30 min，ddH2O淋洗1 min；3%碳酸鈉+0.019%甲醛顯色至條帶清晰；10%冰乙酸終止顯色2 min，ddH2O淋洗1 min。最后予保鮮膜覆蓋、拍照、分析并記錄結(jié)果。SSCP結(jié)果判定：以等位條帶泳動異?；蚨喑鲇緞訔l帶初步判斷存在點(diǎn)突變，篩選出來的樣本進(jìn)一步予DNA序列分析確認(rèn)。

1.2.4 DNA序列分析 取20 μL PCR產(chǎn)物送予北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。其中，K-ras-exon 2 PCR產(chǎn)物從正、反兩個方向測序，K-ras-exon 3 PCR產(chǎn)物從反向測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本組資料為計(jì)數(shù)資料，以百分?jǐn)?shù)表示。應(yīng)用SPSS 13.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 1 K-ras基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳成像圖（6 cm:6 cm）。1-2：NSCLC癌組織；3：癌旁正常肺組織；M：50 bp DNA marker；4-5；NSCLC癌組織；6：癌旁正常肺組織。Fig 1 Gel electrophresis photographs of PCR amplified products for K-ras gene (6 cm:6 cm). 1-3: K-ras-exon 2; 4-6 K-ras-exon 3; 1-2: NSCLC tissues;3: adjacent normal tissues; M: 50 bp DNA marker; 4-5: NSCLC tissues; 6:adjacent normal tissues.

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增 以K-ras-exon 2/3引物特異性擴(kuò)增NSCLC癌組織及癌旁正常肺組織，獲得115 bp的K-ras-exon 2片段與131 bp的K-ras-exon 3片段（圖1）。經(jīng)測序驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段相符合。

2.2 SSCP分析 在105例NSCLC癌組織及30例癌旁正常肺組織中，無1例K-ras基因突變（圖2，圖3），即本研究選取的NSCLC病例組的K-ras基因突變率為0（0/105）。期間曾篩選出9例疑似K-ras-exon 2突變的樣本（其銀染后在PAG上表現(xiàn)為兩條ssDNA泳帶之間多出一條泳帶，如圖1箭頭所示），經(jīng)序列分析證實(shí)，均未見堿基突變。

2.3 DNA序列分析 在105例NSCLC癌組織及30例癌旁正常肺組織中，無1例出現(xiàn)K-ras基因密碼子12（GGT）或/和密碼子13（GGC）或/和密碼子61（CAA）中的堿基改變（圖4，圖5）。

圖 2 K-ras-exon 2 PCR產(chǎn)物的SSCP圖像 (3 cm:9 cm)。1-12：已變性的PCR產(chǎn)物；1-7：NSCLC癌組織；8-12：癌旁正常肺組織；M：50 bp DNA marker； 13：未變性的NSCLC癌組織PCR產(chǎn)物，作為實(shí)驗(yàn)對照組。Fig 2 the SSCP image of PCR products for K-ras-exon 2 (3 cm:9 cm).1-12: denatured products of PCR; 1-7: NSCLC tissues; 8-12: adjacent normal tissues; M: 50 bp DNA marker; 13: undenatured product of PCR in NSCLC tissue, as a control group.

圖 3 K-ras-exon 3 PCR產(chǎn)物的SSCP圖像 (3 cm:9 cm)。1-11：已變性的PCR產(chǎn)物；1-8：NSCLC癌組織；9-11：癌旁正常肺組織；M：50 bp DNA marker。Fig 3 the SSCP image of PCR products for K-ras-exon 3 (3 cm:9 cm).1-11: denatured products of PCR; 1-8: NSCLC tissues; 9-11: adjacent normal tissues; M: 50 bp DNA marker.

圖 4 K-ras-exon 2 PCR產(chǎn)物的反向測序圖 (3 cm:9 cm)。K-ras基因密碼子12、13均為野生型即GGT、GGC。Fig 4 The reverse sequencing map of PCR products for K-ras-exon 2 (3 cm:9 cm). codon 12 of K-ras gene: GGT; codon 13 of K-ras gene: GGC.

圖 5 K-ras-exon 3 PCR產(chǎn)物的反向測序圖 (3 cm:9 cm)。K-ras基因密碼子61為野生型即CAA。Fig 5 The reverse sequencing map of PCR products for K-ras-exon 3 (3 cm:9 cm). codon 61 of K-ras gene: CAA.

3 討論

K-ras基因?qū)儆赗AS原癌基因家族，位于12號染色體上，主要功能是編碼P21蛋白質(zhì)（一種分子量為21 kDa的磷蛋白），后者位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)面，對GTP（guanosine triphosphate，三磷酸鳥苷）和GDP（guanosine diphosphate，二磷酸鳥苷）均具有很強(qiáng)的親和性，且具有同源性GTP酶活性，通過接受和傳遞細(xì)胞外生長刺激信號影響細(xì)胞內(nèi)核酶等生物大分子合成，進(jìn)而對細(xì)胞的生長和分化進(jìn)行調(diào)控[4]。當(dāng)K-ras基因Exon 2中的密碼子12、13和Exon 3中的密碼子61發(fā)生點(diǎn)突變而使K-ras基因被激活，可導(dǎo)致p21蛋白在關(guān)鍵位點(diǎn)（第12、13及61）發(fā)生氨基酸改變，引起K-ras蛋白的異常表達(dá)[5]，導(dǎo)致p21蛋白結(jié)構(gòu)改變并一直處于激活狀態(tài)，失去了其原有的信號傳導(dǎo)功能，持續(xù)地激活磷脂酶并產(chǎn)生第二信使，造成細(xì)胞不可控制地增殖、惡變，最終導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。

肺癌中K-ras基因點(diǎn)突變主要發(fā)生在NSCLC，常見的突變位點(diǎn)是K-ras基因Exon 2的密碼子12、13及Exon 3的密碼子61[6]。而NSCLC中近97%的K-ras基因突變涉及密碼子12及13[7]。本研究應(yīng)用PCR-SSCP分析法與PCR-DNA序列分析法聯(lián)合檢測了105例NSCLC癌組織及30例癌旁正常肺組織中K-ras基因密碼子12、13及61的點(diǎn)突變，未發(fā)現(xiàn)有K-ras基因堿基改變，即本研究選取的NSCLC病例組的K-ras基因突變率為0（0/105）。此結(jié)果與西方國家約15%-30%的NSCLC患者存在K-ras基因突變的研究[8,9]發(fā)現(xiàn)明顯不相符合，與國內(nèi)劉峰（2.9%）[10]、Li（5.8%）[11]、張陽（3.8%）[12]、及孫蕾娜（4.7%）[12]等學(xué)者報(bào)道的中國NSCLC患者K-ras基因突變情況亦有所不同。顧其華等[14]應(yīng)用PCR和測序方法分析33例肺鱗癌和27例肺腺癌K-ras基因外顯子2和3的突變，同樣未發(fā)現(xiàn)有K-ras基因密碼子12、13及61中的堿基改變。

考慮主要有以下兩方面原因：一是K-ras基因在廣西地區(qū)NSCLC中確實(shí)突變少或無突變，即K-ras基因突變存在區(qū)域異質(zhì)性；二是實(shí)驗(yàn)中K-ras基因突變檢測存在假陰性，其可能原因主要有：①標(biāo)本取樣不當(dāng)，即正常組織過多而腫瘤組織過少，造成突變檢測結(jié)果假陰性；②檢測方法有待優(yōu)化，目前檢測基因點(diǎn)突變的方法較多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，本研究應(yīng)用了諸多方法中的PCR-SSCP分析法與PCR-DNA序列分析法。PCR-SSCP分析法是根據(jù)DNA單鏈在非變性PAGE中，其遷移率除與鏈的長短有關(guān)外，更主要決定于單鏈所形成的二級空間構(gòu)象，若DNA片段中堿基發(fā)生突變，將會引起單鏈DNA二級空間結(jié)構(gòu)的改變，使SSCP凝膠上出現(xiàn)異常移動的泳帶。PCR-SSCP分析法是一種快速、靈敏且有效檢測基因點(diǎn)突變的方法，其突變檢出率在50%-80%之間，但它不能識別突變位置，且當(dāng)堿基轉(zhuǎn)換或顛換不影響DNA構(gòu)像時其檢出率較低，如當(dāng)G-T之間的顛換，其檢出率為57%，而且突變位點(diǎn)周圍序列的變化對SSCP分析結(jié)果影響非常小，檢測存在假陰性。除實(shí)驗(yàn)條件的局限之外，少數(shù)突變不能檢出可能是由于點(diǎn)突變引起的空間構(gòu)象變化甚微、遷移率相差無幾所致，尤其是點(diǎn)突變發(fā)生在擴(kuò)增片段的兩端時[15]。本實(shí)驗(yàn)中有9例樣本出現(xiàn)異常泳帶而序列分析證實(shí)無堿基突變，考慮是在某個溫度、某種電泳緩沖液濃度或是一定配比的凝膠中，一個等位基因會有兩種構(gòu)象，在非變性凝膠中電泳就會有兩條泳帶[16]。PCR-DNA序列分析法即直接測序法，是國際上公認(rèn)的基因突變檢測方法。由各種突變檢測技術(shù)檢測到的突變最后都得由測序來確定突變類型及突變位置，而且測序法檢測突變的效率達(dá)到100%。當(dāng)然，直接測序法也不能被當(dāng)成是突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數(shù)據(jù)。綜合分析，通過嚴(yán)格取材，聯(lián)合應(yīng)用PCR-SSCP分析法與PCR-DNA序列分析法，部分樣本經(jīng)二次、甚至多次測序確認(rèn)等措施，本研究已將K-ras基因突變檢測中存在的假陰性率控制到了最低。故考慮K-ras基因在廣西地區(qū)NSCLC中突變少或無突變是由其區(qū)域異質(zhì)性所致。

K-ras基因表達(dá)產(chǎn)物作為重要的表皮生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)子，其基因突變與患者對EGFR-TKIs耐藥呈正相關(guān)，故對K-ras測序可能有助于選擇患者接受TKI治療[17]。本研究中，廣西地區(qū)NSCLC中K-ras基因野生型的比例高，提示廣西地區(qū)NSCLC患者更能從EGFRTKIs治療中獲益。由于納入研究的樣本量相對較少，有待更多大樣本進(jìn)行進(jìn)一步的研究。