李銳 張道榮 蔡存?zhèn)?董經(jīng)宇

Claudins是緊密連接的骨架蛋白，參與維持緊密連接的選擇滲透性和細(xì)胞的極性，至今發(fā)現(xiàn)有24個(gè)亞型，主要分布于皮膚、腦、神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)臟組織中。Claudin-7是Claudins家族成員之一，調(diào)節(jié)腎細(xì)胞間側(cè)Cl-和Na+的滲透性。起初Claudin-7是作為抑癌基因被發(fā)現(xiàn)的，但目前的研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤中的表達(dá)存有差異性，如食管癌[1]中Claudin-7的表達(dá)降低或缺失可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，但在胃腺癌[2]和卵巢癌[3]中Claudin-7的表達(dá)較周圍正常組織升高，并且升高的Claudin-7與腫瘤的浸潤深度和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的重要調(diào)節(jié)因子，通過與靶基因啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合抑制蛋白轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)EMT，使腫瘤細(xì)胞變得具有遷移性和侵襲性。在食管鱗癌和乳腺癌細(xì)胞系中Snail及其同系物SNAI1P可通過與Claudin-7啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄[4,5]。Manzanares等[6]發(fā)現(xiàn)，Slug與Snail具有高度的同源性，在N末端都含有調(diào)控Claudin-7的關(guān)鍵序列SNAG反式轉(zhuǎn)錄區(qū)，并且在人類Claudin-7啟動(dòng)子上含有7個(gè)E-box，為Slug的轉(zhuǎn)錄抑制提供了結(jié)合位點(diǎn)，那么Slug是否能調(diào)控Claudin-7的表達(dá)呢？

本實(shí)驗(yàn)擬采用免疫組織化學(xué)SP方法和Western blot檢測Slug與Claudin-7蛋白在肺癌組織、癌旁正常肺組織的表達(dá)情況，分析不同類型肺癌組織中Slug與Claudin-7的表達(dá)差異性，以及與其臨床病理因素之間的關(guān)系，并初步探討這兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 101例原發(fā)性肺癌組織和40例癌旁肺組織均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004年8月-2010年5月外科手術(shù)切除標(biāo)本，其中男性60例，女性41例；平均年齡56.8歲；所有患者術(shù)前均未接受放、化療。標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，HE常規(guī)染色后明確診斷。分別由兩名病理醫(yī)師根據(jù)2003年WTO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)和TNM分期系統(tǒng)，確定腫瘤的組織類型和臨床病理分期。包括：鱗癌52例，腺癌49例；高分化33例，中分化42例，低分化26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者63例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例；Ia期15例，Ib期19例，IIa期21例，IIb期18例，IIIa期13例，IIIb期9例，IV期6例。

30對新鮮肺癌組織及其癌旁肺組織（遠(yuǎn)離腫瘤至少5 cm）取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2009年6月-2010年5月手術(shù)切除標(biāo)本。術(shù)中切除后立即置于-70oC冰箱保存，用于提取組織蛋白。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人Claudin-7多克隆抗體（34-9100）購自美國Invitrogen公司，兔抗人Slug多克隆抗體（bs-1382R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm切片。采用免疫組化SP法檢測肺鱗癌、腺癌組織中Claudin-7（1:200）和Slug（1:150）蛋白表達(dá)。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性肺癌切片作陽性對照。

1.3.2 Western Blot 取50 mg左右大小的組織塊（包括肺癌組織及配對癌旁肺組織），放入500 μL裂解液中冰浴下勻漿，4oC靜置20 min，低溫高速離心（4oC，15,000轉(zhuǎn)/分，15 min），收集上清。加樣，上樣總蛋白量80 μg。10%SDS電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上（50 V，4oC濕轉(zhuǎn)120 min）。5%脫脂奶粉封閉2 h，加兔抗人多克隆Claudin-7抗體（1:300）和兔抗人多克隆Slug抗體（1:300），4oC孵育過夜，TTBS漂洗3次后，加二抗溫育2 h，TTBS漂洗3次后ECL發(fā)光。結(jié)果經(jīng)自動(dòng)凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測定。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽性染色，每張切片在400倍鏡下觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%-50%為2分，50%-75%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；最后按照乘積分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級：“-”（0-2），“+”（3-4），“++”（6-8），“+++”（9-12）。結(jié)果判定：分?jǐn)?shù)≥3定為陽性，＜3為陰性。

1.4.2 Western blot結(jié)果判定 Claudin-7條帶在22 kDa處，Slug條帶在30 kDa處，利用Image J軟件半定量分析特異性條帶的光密度值，取其與β-actin的比值作為相對表達(dá)量進(jìn)行比較分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，對Claudin-7和Slug表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)；Claudin-7和Slug表達(dá)的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析，采用t檢驗(yàn)分析Western blot圖像灰度值。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.1.1 Claudin-7與Slug在正常肺組織和肺癌組織中的表達(dá) Claudin-7在40例正常肺組織中高表達(dá)，表達(dá)率為95%（38/40），表達(dá)主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿；Slug在正常肺組織中低表達(dá)，表達(dá)率為37.5%（15/40），以胞漿表達(dá)為主（圖1）。在101例肺癌組織中Claudin-7陽性表達(dá)58例（57.4%），表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，少量定位于細(xì)胞核，在肺鱗癌和腺癌中的表達(dá)較正常肺組織明顯減弱；Slug陽性表達(dá)83例（75.8%），表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，在肺鱗癌和腺癌中的表達(dá)較正常肺組織明顯增高（圖1）。隨著分化程度的降低，Claudin-7的表達(dá)逐漸減弱甚至缺失，而Slug表達(dá)則逐漸增強(qiáng)，并在低分化的癌組織中出現(xiàn)較強(qiáng)的核表達(dá)。

2.1.2 Claudin-7和Slug蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系 Claudin-7與Slug蛋白在肺鱗癌和腺癌中的表達(dá)情況詳見表1。101例肺鱗癌和腺癌中Claudin-7的陽性表達(dá)率與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。而Slug除與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系外，還與TNM分期相關(guān)。隨著分化程度的降低，Claudin-7的陽性表達(dá)率則明顯下降（P=0.001），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中Claudin-7陽性表達(dá)率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織明顯降低（P＜0.001）。而隨著分化程度的降低Slug的陽性表達(dá)率逐漸升高（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中其陽性表達(dá)率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織明顯增高（P＜0.05）。不同TNM分期中Slug的陽性表達(dá)率隨著分期的升高而升高（P＜0.05）。Claudin-7與Slug蛋白的表達(dá)與性別、年齡、病理組織學(xué)分型均無明顯關(guān)系。

2.1.3 Claudin-7與Slug蛋白表達(dá)的相關(guān)性 如表2所示，101例肺癌中42例Claudin-7與Slug同時(shí)陽性表達(dá)，2例同時(shí)陰性表達(dá)，Claudin-7陽性表達(dá)而Slug陰性表達(dá)為16例，Slug陽性表達(dá)而Claudin-7陰性表達(dá)為41例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示Slug與Claudin-7的蛋白表達(dá)具有明顯負(fù)相關(guān)性（r=-0.566,8）。

2.2 Western Blot中Claudin-7與Slug在肺癌組織中的表達(dá) Claudin-7和Slug在30對肺癌組織及其癌旁肺組織中均有不同程度的表達(dá)（圖2）。其中Claudin-7在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁肺組織，平均灰度值分別是1.04±0.23和6.02±1.34（P=0.004）。Slug在癌組織中的表達(dá)明顯高于對應(yīng)癌旁肺組織，平均灰度值分別是5.83±1.25和2.81±0.48（P=0.037）。

圖 1 Claudin-7與Slug在肺癌組織中的表達(dá)（SP，×400）。SCC：鱗癌；ADC：腺癌；H：分化較好；L：分化較差。Fig 1 The expression of Claudin-7 and Slug in lung cancers (SP, ×400). SCC: lung squamous cell carcinoma; ADC: adenocarcinoma; H: well differentiated; L: poorly differentiated.

圖 2 Western blot檢測肺癌組織及其癌旁組織中Claudin-7和Slug的表達(dá)。A：肺鱗癌、腺癌中Claudin-7和Slug的蛋白表達(dá)情況；T1, 2：SCC；T3, 4：ADC；N：癌旁組織；B：Claudin-7和Slug蛋白的相對表達(dá)量。 *：P＜0.05。Fig 2 Expression of Claudin-7 and Slug protein in lung cancer tissues and paracancerous specimens by Western blot.A: Result of Western blot for expressions of Claudin-7 and Slug in lung quamous cell carcinoma and adenocarcinoma;T1, 2: SCC; T3, 4: ADC; N: paracancerous specimens; B: The histogram of relative expression rate of Claudin-7 protein compared to Slug. *: P＜0.05.

表 1 Claudin-7和Slug的表達(dá)及與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab 1 Associations between expression of Claudin-7 and Slug and clinicopathologic parameters

表 2 Claudin-7與Slug在肺癌中表達(dá)的關(guān)系Tab 2 Correlation between Claudin-7 and Slug expression

3 討論

癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，首先必須從原發(fā)癌灶中脫離出來，而細(xì)胞之間粘附結(jié)構(gòu)功能的改變則使惡性腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)組織。Claudins的潛在作用在于限制癌細(xì)胞的營養(yǎng)和生長因子供應(yīng)，在癌中失去緊密連接蛋白在膜上的定位是腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)鍵步驟。Kominsky等[7]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中Claudin-7的蛋白和mRNA水平降低，并與癌組織級別呈負(fù)相關(guān)；并且在口腔鱗癌中Claudin-7的表達(dá)減少與臨床級別和術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Claudin-7在肺鱗癌、腺癌組織中的表達(dá)較正常肺組織減弱，并在分化較差和有轉(zhuǎn)移的癌組織中下降較明顯，甚至表達(dá)缺失。但是在其他腫瘤如胃腺癌[2]，卵巢癌[3]中，Claudin-7的表達(dá)反而升高，并且與腫瘤惡性程度增高有關(guān)，這提示Claudin-7在腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Claudin-7在癌組織中以胞漿表達(dá)為主，可能與Claudin-7參與細(xì)胞分化及其他因子的調(diào)控有關(guān)[9,10]。奇怪的是Claudin-7在正常肺組織中也出現(xiàn)了較強(qiáng)的胞漿表達(dá)，并且在膽囊[11]和食管[10]上皮基底層中也有類似發(fā)現(xiàn)，可能與Claudin-7的表達(dá)受周圍微環(huán)境的影響有關(guān)，但具體機(jī)制不詳。

在EMT中上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞獲得了更強(qiáng)的活動(dòng)和侵襲能力，從而穿越細(xì)胞外基質(zhì)在血管和淋巴管中停留，啟動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步。本研究中，Slug在肺癌中的表達(dá)明顯增高，隨著肺癌細(xì)胞分化程度的下降而呈上升趨勢，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)；在結(jié)腸癌中Slug的高表達(dá)與Dukes分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]，這與我們的研究結(jié)果一致。但Shih等[13]通過RT-PCR在肺腺癌中研究發(fā)現(xiàn)，Slug的mRNA高表達(dá)與患者的術(shù)后復(fù)發(fā)和較短生存期有關(guān)，但是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，可能與其樣本量較少有關(guān)。

目前關(guān)于Claudin-7的調(diào)節(jié)因子是個(gè)研究熱點(diǎn)，除Snail與SNAI1P之外，ELF3是Claudin-7正性轉(zhuǎn)錄因子，可上調(diào)Claudin-7的表達(dá)[14]，而在正常的結(jié)直腸上皮中TCF4通過與SOX-9作用抑制Claudin-7的表達(dá)，但是這種抑制作用在腫瘤中卻失去了功效[15]。在哺乳動(dòng)物中Slug與Snail具有高度的同源性，兩者都通過與啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合抑制occludin、ZO-1、Claudin-1和E-cadherin的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，說明作為EMT的誘導(dǎo)因子Slug可通過抑制緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄促進(jìn)EMT發(fā)生，在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在分化較差的肺癌組織中Slug主要在核表達(dá)，而Claudin-7表達(dá)明顯減弱甚至缺失，而且統(tǒng)計(jì)分析也證實(shí)了Slug與Claudin-7在肺癌中的表達(dá)具有明顯的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），因此我們大膽推測Slug可能通過與Claudin-7啟動(dòng)子上的E-box結(jié)合進(jìn)而調(diào)控Claudin-7的表達(dá)，但這有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。