秦學(xué)博 劉彬 李洋 尤嘉琮 周清華

肺癌是世界上死亡率最高的一種惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占到了肺癌總數(shù)的80%[1,2]。在NSCLC中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）常存在過度表達(dá)和異常激活[2]，且EGFR信號通路在癌癥發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、凋亡等方面有著重要作用。因此，以阻斷EGFR功能為目標(biāo)的分子靶向治療逐漸應(yīng)用到臨床[3]。吉非替尼（Gefitinib，商品名為易瑞沙，Iressa）可以特異性地抑制EGFR自身磷酸化，阻斷其信號傳導(dǎo)，從而起到抗腫瘤作用[4]，對老年肺腺癌及復(fù)發(fā)的NSCLC療效明顯[5,6]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有對吉非替尼治療有效的病例在經(jīng)過一定時間的緩解期后都會產(chǎn)生吉非替尼的獲得性耐藥。因此，研究其耐藥機制具有重大的理論和臨床意義[7]。本研究以吉非替尼敏感肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9與吉非替尼耐藥肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9/AB11為細(xì)胞模型，通過microRNA芯片技術(shù)分析比較吉非替尼敏感和耐藥的肺腺癌細(xì)胞株的microRNAs表達(dá)譜差異，篩選與肺腺癌吉非替尼獲得性耐藥相關(guān)的microRNAs。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 本實驗用吉非替尼敏感的人肺癌細(xì)胞株P(guān)C9細(xì)胞，及其衍生的獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/AB11細(xì)胞均由同濟大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院腫瘤研究所惠贈。

1.1.2 試劑與材料 RPIM-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），小牛血清（Gibco公司），0.25%胰酶（Gibco公司），吉非替尼片（阿斯利康公司），MTT（Sigma公司），miRNeasy Mini Kit（QIAGEN公司），microRNA芯片（Affymetrix公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞使用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37oC恒溫、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，耐藥株P(guān)C-9/AB11細(xì)胞以吉非替尼終濃度為0.05 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞密度至80%時以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，倒置相差顯微鏡（Nikon）下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的差異。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 取同樣處于對數(shù)生長期的細(xì)胞約1×106個，PBS洗滌，離心，加入PI染色液，F(xiàn)ACSAriaTM流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）檢測細(xì)胞周期。重復(fù)3次。

1.2.4 計數(shù)法繪制生長曲線 細(xì)胞鋪板接種數(shù)以7天-10天長滿為宜，共設(shè)10個點，每24 h計數(shù)1個點，每個點設(shè)3個重復(fù)。利用公式1[Td=T×lg2/lg(N/N0)，Td：倍增時間；T：間隔時間；N：終點細(xì)胞數(shù)；N0：起點細(xì)胞數(shù)]計算倍增時間。

1.2.5 MTT法測細(xì)胞耐藥指數(shù) 取狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，按每孔8×103個細(xì)胞，每孔體積100 μL，接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，依次更換為吉非替尼終濃度為0 μmol/L、0.2 μmol/L、0.5 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的培養(yǎng)基，0 μmol/L為對照孔，不加細(xì)胞者為調(diào)零孔。每濃度設(shè)置6復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，向每孔加入新鮮MTT（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，37 °C低速震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm波長各孔吸光值（D）。按公式2計算細(xì)胞生長抑制率，公式2：細(xì)胞生長抑制率=（D對照組-D實驗組）/D對照組×100%。繪制不同濃度下細(xì)胞生長抑制率曲線，并用Graphpad Prism 5.0軟件計算吉非替尼的半數(shù)抑制濃度（IC50）。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 microRNA表達(dá)譜檢測 參照Affymetrix公司推薦方案用Trizol法提取總RNA，將制備好的RNA注入已備好的芯片，用1/2"Tough-Spots蓋上兩側(cè)隔片，將芯片放入雜交爐，48 °C，60 rpm孵育16 h，從雜交爐取出芯片，去掉Tough-Spots，提取hybridization cocktail移入新管，降至室溫后進(jìn)行洗脫和染色。利用芯片掃描工作站3000系統(tǒng)（GeneChip 3000 7G，Affymetrix公司）掃描芯片。應(yīng)用free miRNA QC Tool software初步分析結(jié)果。應(yīng)用MiRNA QC Tool軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將芯片所有探針組的Signal從小到大排序，去掉最大的2%和最小的2%后，將剩下探針組的平均信號值調(diào)整到500。差異miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)：①信號ratio≥2為上調(diào)miRNA；②信號ratio≤0.5為下調(diào)miRNA。

1.2.7 Real-time PCR檢測 隨機選取表達(dá)具有明顯差異的microRNA進(jìn)行real-time PCR實驗。設(shè)計待檢測microRNA引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行real-time PCR，分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，兩樣本均值比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 1 PC9細(xì)胞（A）與PC9/AB11細(xì)胞（B）形態(tài)學(xué)比較Fig 1 The morphology between PC9 cell line (A) and PC9/AB11 cell line (B)

圖 2 PC9細(xì)胞與PC9/AB11細(xì)胞的細(xì)胞周期分布Fig 2 Comparison of the distribution of cell cycle between PC9 cell line and PC9/AB11 cell line

圖 3 PC9細(xì)胞與PC9/AB11細(xì)胞的生長曲線Fig 3 Growth curves between PC9 cell line and PC9/AB11 cell line

圖 4 不同濃度吉非替尼對PC9細(xì)胞和PC9/AB11細(xì)胞的抑制率Fig 4 The suppressive rates of Gefitinib on PC9 cell line and PC9/AB11 cell line at different concentrations of Gefitinib

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較 在倒置相差顯微鏡低倍鏡下觀察，PC9呈不規(guī)則多角形，PC9/AB11呈梭形，細(xì)胞接觸抑制消失，有少量細(xì)胞堆積現(xiàn)象（圖1）。

2.2 細(xì)胞周期測定 PC9與PC9/AB11在G0/G1期分別為（52.14±0.95）%和（58.36±2.09）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；S期分別為（43.24±0.74）%和（36.06±1.80）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；G2/M期分別為（4.62±0.74）%和（5.58±0.33）%，兩組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖2）。

2.3 繪制生長曲線并計算倍增時間 當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，計算細(xì)胞倍增時間，由公式1計算PC9和PC9/AB11的倍增時間分別是（25.80±1.59）h和（56.05±1.95）h，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4 吉非替尼對PC9及PC-9/AB11的IC50由公式2計算PC9和PC9/AB11細(xì)胞的抑制率，以吉非替尼濃度為因變量，以細(xì)胞抑制率為應(yīng)變量，繪制兩種細(xì)胞的生長抑制曲線。通過Graphpad Prism 5.0軟件計算PC9和PC9/AB11細(xì)胞的IC50分別為（0.02±0.01）μmol/L和（2.07±0.11）μmol/L， 兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

2.5 MicroRNA芯片結(jié)果 將PC9細(xì)胞和PC9/AB11細(xì)胞分別進(jìn)行microRNA芯片檢測，芯片雜交結(jié)果的掃描圖如圖5所示。芯片結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，PC9細(xì)胞與PC9/AB11細(xì)胞共有13個microRNA的表達(dá)水平具有明顯性差異，PC9/AB11細(xì)胞相對于PC9細(xì)胞高表達(dá)的microRNA有4個，低表達(dá)的有9個。

2.6 Real-time PCR驗證結(jié)果 隨機抽取芯片結(jié)果中的miR-138進(jìn)行real-time PCR驗證，引物設(shè)計如表1所示。real-time-PCR結(jié)果顯示，miR-138在PC9細(xì)胞中的2-△△Ct值為（1.005,0±0.086,3），PC9/AB11細(xì)胞中2-△△Ct值為（0.008,4±0.000,6），差異明顯（P＜0.05）（圖6）。與芯片結(jié)果一致。

圖 5 PC9細(xì)胞（A）與PC9/AB11細(xì)胞（B）microRNA芯片雜交圖Fig 5 PC9 cell line (A) and PC9/AB11 cell line (B) microarray scans

圖 6 MicroRNA-138在PC9和PC9/AB11中的表達(dá)比較Fig 6 Comparison of the expression level of microRNA-138 between PC9 cell line and PC9/AB11 cell line

表 1 逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR中microRNA-138引物序列Tab 1 The primer sequence of microRNA-138 in reverse transcription and real-time PCR

3 討論

吉非替尼是針對EGFR酪氨酸激酶抑制劑的靶向治療藥物，對于EGFR突變和高拷貝EGFR基因的腫瘤具有較好的敏感性[8,9]，患者病情可以得到緩解甚至長期帶瘤生存，但是部分患者在經(jīng)過3個月-7個月的緩解期后出現(xiàn)了病情進(jìn)展[10]，繼續(xù)應(yīng)用吉非替尼未能取得任何效果，此類患者出現(xiàn)了獲得性耐藥。研究[11]發(fā)現(xiàn)吉非替尼獲得性耐藥的產(chǎn)生是多種機制作用的結(jié)果。Kobayashi等[12]首次報道了EGFR基因外顯子20的C→T的點突變所導(dǎo)致第790位甲硫氨酸取代蘇氨酸（T790M）是導(dǎo)致吉非替尼耐藥的原因。此后，有多個研究小組[13,14]發(fā)現(xiàn)在發(fā)生獲得性耐藥的腫瘤內(nèi)（具有L858R或delE746-A750突變）檢測到了T790M二次突變。這一現(xiàn)象表明，應(yīng)用吉非替尼治療可能給予具有T790M突變的腫瘤細(xì)胞一種選擇性生長優(yōu)勢，從而導(dǎo)致最終出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。EGFR信號通路與腫瘤耐藥有密切關(guān)系，Koizumi等[15]在PC-9及PC-9/ZD細(xì)胞中分析了EGFR及其銜接蛋白GRB2、SOS和Shc形成的復(fù)合物的差別。結(jié)果顯示，異常的銜接蛋白介導(dǎo)的EGFR到AKT的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是PC-9/ZD細(xì)胞中吉非替尼獲得性耐藥的一個機制。Uchida等[16]將致癌的K-Ras突變體轉(zhuǎn)染入吉非替尼敏感的細(xì)胞株內(nèi)（PC-9和具有EGFR-L858R突變的293T細(xì)胞），驗證了下游信號通路中的突變導(dǎo)致的信號激活可以導(dǎo)致肺癌中吉非替尼獲得性耐藥。Jeffrey等[17]證實持續(xù)活化的PI3K/Akt信號通路在吉非替尼耐藥的過程中起到了一定的作用。PTEN的主要作用機制是Akt的去磷酸化作用，可以降低細(xì)胞內(nèi)Akt的水平，發(fā)揮與PI-3K相反的作用。She等[18]發(fā)現(xiàn)PTEN的失活可以導(dǎo)致EGFR信號通路的異常，進(jìn)而引起吉非替尼耐藥。

MicroRNA是一種內(nèi)源性的非編碼的RNA序列，一般由21 nt-23 nt組成單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物體中[19]，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)[20]。人們相繼發(fā)現(xiàn)microRNA參與人體多種生命活動，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]，對細(xì)胞的凋亡通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[22]，參與細(xì)胞周期的調(diào)控[23]，參與人體的代謝過程[24,25]等。MicroRNA不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、周期調(diào)控等，對腫瘤的化療耐藥也具有重要作用。Meng等[26]利用裸鼠構(gòu)建膽管癌細(xì)胞移植瘤模型，在給予吉西他濱處理后有大量的microRNAs表達(dá)水平改變，證實microRNA可能參與了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的反應(yīng)。有研究[27]表明卵巢癌中高表達(dá)的miR-214可引起卵巢癌細(xì)胞對順鉑耐藥，Blower的研究組發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)水平可導(dǎo)致藥物對細(xì)胞生長抑制效應(yīng)的改變，miR-16也可以引起部分藥物-細(xì)胞對的藥效遷移[28,29]，表明MicroRNA是參與腫瘤化療藥耐藥的重要因子。microRNA可能也參與了腫瘤的吉非替尼獲得性耐藥。在乳腺癌細(xì)胞SKBr3中轉(zhuǎn)染miR-205的表達(dá)載體后，SKBr3細(xì)胞對吉非替尼的敏感度增加[25,30]。miR-128b可以靶向EGFR，在多例NSCLC腫瘤標(biāo)本中可以檢測到miR-128b基因的雜合性缺失，并且miR-128b基因的雜合缺失與吉非替尼用藥后的臨床效果及生存明顯相關(guān)[31]。在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-let-7a、miR-126和miR-145能夠抑制AKT和ERK的活性，并增加肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感度，轉(zhuǎn)染miR-126的表達(dá)載體后可使肺癌細(xì)胞的耐藥指數(shù)增加6倍[32]。

本實驗采用microRNA芯片對吉非替尼敏感株P(guān)C9細(xì)胞及由其衍生來的耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/AB11細(xì)胞進(jìn)行研究，在篩選出來的microRNAs中，多種microRNAs都參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、周期及腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移等過程。MiR-138限制在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)，而他的前體pre-miR-138-2廣泛的在所有組織中表達(dá)。pre-miR-138-2從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，表明Dicer切割pre-microRNA的過程限制了一定的組織和細(xì)胞類型。因此，不同的premicroRNA可能是控制microRNA功能的機制之一[33]。miR-138在神經(jīng)內(nèi)管發(fā)育過程中，可能靶向于KDM6B的表達(dá)[34]；microRNA-138直接靶作用于EID-1的3'UTR區(qū)，負(fù)性調(diào)控機體的脂肪細(xì)胞生成過程[35]；還可以促進(jìn)少突細(xì)胞的分化和髓鞘形成[36]；在先天無腦畸形的患兒組織里，miR-138明顯下調(diào)，可能與先天無腦畸形的形成有關(guān)[37]。MicroRNA可以在轉(zhuǎn)錄后的水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。Liu等[38]研究表明，miR-138在頭頸部腫瘤中可以抑制腫瘤侵襲促進(jìn)凋亡；Mitomo[39]研究表明，miR-138可能通過作用于端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶參與了甲狀腺癌的發(fā)生。Zhao等[40]的研究證實miR-138也參與了腫瘤化療耐藥，miR-138可以顯著下調(diào)多重耐藥基因的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞株的多重耐藥。

本研究中，我們的實驗結(jié)果提示microRNA對肺腺癌細(xì)胞的吉非替尼獲得性耐藥的產(chǎn)生可能具有重要作用。在此研究基礎(chǔ)上我們將對microRNA對肺癌細(xì)胞的吉非替尼獲得性耐藥產(chǎn)生機制進(jìn)行深入研究。本研究為全面、深入研究肺腺癌靶向治療耐藥的分子機制，篩選可預(yù)測肺腺癌靶向治療療效的microRNAs標(biāo)志物提供了實驗基礎(chǔ)。