劉婷 王曉琨 張黎川

近年來，我國肺癌發(fā)病率逐年上升，分別占男性和女性惡性腫瘤的第一位和第二位，而化療耐藥是導致其治療失敗的主要原因之一。化療的耐藥性是多因素參與的過程，除了與腫瘤自身的基因類型有關外，還與腫瘤細胞所處的微環(huán)境密切相關[1]。腫瘤細胞在受到藥物等不利因素刺激時，可誘導產(chǎn)生自身保護作用的熱休克蛋白（heat shock protein, Hsp）。Hsps與腫瘤耐藥性關系的研究已引起學者廣泛的關注。Hsps多以分子伴侶的形式參與細胞的損失與修復，其高表達可增強腫瘤細胞的抗凋亡能力，并能引起細胞對化療的耐藥性增加[2]。Hsp90作為Hsps家族中拮抗細胞凋亡的主要蛋白，其眾多底物蛋白參與了腫瘤細胞的生長調(diào)控及存活[3]，在促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡的信號轉導過程中發(fā)揮重要作用。研究[4-6]表明Hsp90在肺癌、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤細胞中呈高表達狀態(tài)，并且其持續(xù)高表達的腫瘤細胞能對紫杉醇、順鉑和Doxorubicin等藥物產(chǎn)生抗藥性[7]，降低化療的敏感性[8]。同樣在白血病細胞中發(fā)現(xiàn)，高表達的Hsp90也參與腫瘤的耐藥產(chǎn)生[9]。因此Hsp90已成為抗瘤治療的研究熱點。

萜類物質(zhì)替普瑞酮（geranylgeranylacetone, GGA）作為Hsp70的一種選擇性誘導劑，同樣可以誘導調(diào)節(jié)Hsps中其它成員的表達。有研究[10]報道GGA能夠誘導胃粘膜細胞的Hsp90表達上調(diào)。順鉑是肺癌治療的一線藥物，順鉑的耐藥是臨床治療中不可忽視的問題。目前關于Hsp90的表達與肺癌細胞對順鉑化療耐藥性的研究報道較少。因此，本研究旨在通過應用GGA誘導兩種肺癌細胞系中的Hsp90表達，并分析其在兩種細胞系中表達的不同及與肺癌細胞對順鉑耐藥的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與細胞 人肺腺癌標準細胞株SPCA-1及小細胞肺癌細胞株H446（均購自上海生科院細胞研究所的美國ATCC細胞），GGA、順鉑（Sigma公司），蛋白定量試劑盒、鼠抗人β-actin抗體（碧云天），F(xiàn)ITC標記的羊抗小鼠抗體、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠IgG（北京中杉金橋），多克隆鼠抗、兔抗Hsp90抗體（美國Bioworld公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（北京賽默飛化工）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 5%CO2、飽和濕度、37oC恒溫孵箱，于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SPCA-1及H446細胞，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取指數(shù)生長期的兩種細胞各以5×104個/mL細胞分別接種于100 mL的培養(yǎng)瓶中，長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，PBS液洗2次，待用。細胞隨機分為實驗組與對照組，參照文獻[11]，實驗組加入不同濃度GGA（10 μM、50 μM、100 μM、500 μM、1,000 μM）；對照組加入PBS，培養(yǎng)6 h。然后分別采用免疫細胞熒光化學和Western blot檢測兩種細胞系各組細胞中Hsp90蛋白水平的表達。

1.3 免疫熒光細胞化學檢測Hsp90蛋白水平的表達 消化收集對數(shù)生長期兩種細胞系細胞，于六孔板中的蓋玻片上各以1×105/mL進行細胞爬片，細胞貼壁固定后，加適量培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h后隨機按實驗組和對照組分別處理分組，PBS沖洗，用4%多聚甲醛固定各組細胞15 min，用PBS沖洗3次后，0.2%Triton透膜15 min、0.1%PBST沖洗2次，再用1%BSA封閉30 min，分別加入一抗（多克隆鼠抗人Hsp90抗體1:200），4oC濕盒內(nèi)過夜。PBS沖洗后，避光加入二抗（FITC標記的羊抗鼠抗體1:100），37oC雜交1 h。最后PBS沖洗，濾紙吸干后封片。在激光共聚焦488 nm處觀察各組細胞Hsp90出現(xiàn)的位置及強度變化。

1.4 Western blot法檢測Hsp90蛋白水平的表達 消化收集兩種細胞系的各培養(yǎng)瓶中細胞于1.5 mL Ep管中，加入含10 μL/mL的蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液400 μL，置冰上裂解30 min，以12,000 rpm、4oC離心15 min，取上清轉移至新管，重復離心2次，-70oC保存待測；BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，進行SDS-PAGE恒壓100 V電泳90 min、恒流300 mA濕式電轉印2 h。將轉印的PVDF膜放入封閉液中4oC過夜，分別加入稀釋的兔抗人Hsp90抗體（一抗，1:500）及鼠抗人β-actin（一抗，1:400），37oC孵育2 h，PBST洗膜3次，每次5 min。再加入稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗兔、羊抗鼠IgG（二抗，1:2,000），37oC孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，室溫化學發(fā)光顯色。凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描分析，計算公式為：某樣品Hsp90的相對表達水平=樣品Hsp90的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.5 MTT法檢測GGA誘導對細胞生存率的影響 取對數(shù)生長期兩種細胞系的各組細胞，分別以1×104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度的37oC孵箱培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的順鉑（0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM），每個濃度設3個孔，繼續(xù)培養(yǎng)順鉑組48 h后，再向各孔加入Mヰ 20 μL，4 h后加入DMSO，酶標儀上選擇波長490 nm，檢測各孔OD值，計算細胞生存率。細胞生存率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。應用Modif i ed Kaber method法求出細胞的半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentriton, IC50），并求得耐藥指數(shù)。耐藥指數(shù)（resistance index, RI）=IC50實驗組/IC50對照組。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，所有實驗均重復3次以上，實驗數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hsp90蛋白水平的表達 采用免疫熒光化學的方法，比較實驗組與對照組細胞Hsp90蛋白的表達。用FITC染色后，在488 nm激發(fā)光的激發(fā)下，NIKON C1激光共聚焦顯微鏡下觀察，在兩種細胞系中均可見該蛋白主要分布于細胞核周圍及胞漿中。與相對應的對照組相比，兩種細胞系的各實驗組細胞的熒光強度均隨GGA濃度的增加呈現(xiàn)明顯增強趨勢，Hsp90蛋白表達逐漸增加（圖1）。

為了進一步確定Hsp90的蛋白表達水平變化的差異，采用Western blot雜交的方法來檢測SPCA-1及H446各組細胞中Hsp90的相對表達量（圖2，圖3）。表1顯示，SPCA-1細胞中，當GGA的濃度為10 μM-1,000 μM時，Hsp90蛋白表達量逐漸增高且隨GGA呈濃度依賴性增高（除了10 μM與0 μM比較無統(tǒng)計學差別外），其表達水平與對照組相比提高了0.2倍-1.0倍。與SPCA-1細胞相似，在H446細胞中Hsp90蛋白表達量也與GGA呈濃度依賴性增加，分別與對照組相比提高了0.6倍-2.1倍（GGA濃度為100 μM-1,000 μM時）。

GGA可以誘導人肺腺癌細胞SPCA-1及小細胞肺癌細胞H446中Hsp90的表達。兩種細胞系中，在一定范圍內(nèi)，Hsp90的表達在蛋白水平隨誘導劑呈濃度依賴性的上調(diào)。在SPCA-1細胞，當GGA濃度在50 μM時開始出現(xiàn)誘導效應，在1,000 μM時達到最大效應（與對照組相比提高了1.0倍）；在H446細胞中，Hsp90的表達與其相似，但在GGA濃度為100 μM時才開始出現(xiàn)誘導效應，在1,000 μM時達到最大效應（與對照組相比提高了2.1倍）。統(tǒng)計學分析顯示，在非小細胞肺癌SPCA-1中，Hsp90的表達與誘導劑的濃度梯度依賴性更明顯。

2.2 GGA誘導對細胞生存率的影響 為了研究GGA誘導Hsp90的表達與兩種細胞對順鉑敏感性的相關性比較了不同濃度GGA（0 μM-1,000 μM）誘導下細胞的IC50值。結合細胞在不同濃度順鉑（0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM）作用下的生存曲線（圖4），在SPCA-1細胞中，與對照組IC50值4.74±0.23相比，當GGA濃度依次為10 μM、50 μM、100 μM、500 μM、1,000 μM時，實驗組IC50的值分別為：5.71±0.11、6.27±0.77、6.42±0.03、7.12±0.02和7.25±0.04。同樣，在H446細胞中對照組的IC50值為4.28±0.22；GGA濃度依次增加時，實驗組的IC50值分別為4.73±0.08、5.57±0.15、6.23±0.17、7.12±0.02和7.69±0.08。結果表明：在相同濃度順鉑作用下，兩種肺癌細胞系GGA各誘導組細胞的耐藥率均明顯高于所對應的對照組（P＜0.05），且細胞的耐藥性與Hsp90的表達量成正比。最大RI分別為1.52（SPCA-1細胞）及1.79（H446細胞）（GGA濃度為1,000 μM）。在SPCA-1及H446兩種細胞中，Hsp90的表達均與細胞對順鉑的耐藥性有關。

表 1 不同濃度GGA誘導下SPCA-1、H446細胞Hsp90蛋白水平的相對表達Tab 1 Expression of Hsp90 protein in SPCA-1 and H446 cells exposed to GGA at different concentrations

圖 1 免疫熒光細胞化學法檢測SPCA-1及H446細胞中不同濃度GGA作用下的Hsp90蛋白表達（×400）Fig 1 Expression of Hsp90 protein detected by immunofluorescence in SPCA-1 and H446 cells (×400)

圖 2 不同濃度GGA誘導下SPCA-1細胞中Hsp90蛋白水平的表達。A：Western blot測定不同GGA濃度（0 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1,000 μM）作用6 h后SPCA-1細胞中的Hsp90蛋白水平的表達；B：柱狀圖示Hsp90相對β-actin的表達量。Fig 2 Expression of Hsp90 protein in SPCA-1 cells exposed to GGA at different concentrations. A: Western blot results of Hsp90 protein in SPCA-1 cells exposed to GGA at different concentrations (0 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1,000 μM) for 6 h; B: Bar graph showing the relative level of Hsp90 protein evaluated using the ratio of of IODHsp90/IODβ-actin.

圖 3 不同濃度GGA誘導下H446細胞中Hsp90蛋白水平的表達。A：Western blot測定不同GGA濃度（0 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1,000 μM）作用6 h后H446細胞中的Hsp90蛋白水平的表達；B：柱狀圖示Hsp90相對β-actin的表達量。Fig 3 Expression of Hsp90 protein in H446 cells exposed to GGA at different concentrations. A: Western blot results of Hsp90 protein in H446 cells exposed to GGA at different concentrations (0 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1,000 μM) for 6 h; B: Bar graph showing the relative level of Hsp90 protein evaluated using the ratio of of IODHsp90/IODβ-actin.

圖 4 不同濃度GGA誘導下的SPCA-1及H446細胞對順鉑的生存曲線。A：圖示不同GGA濃度（0 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1,000 μM）作用6 h后SPCA-1細胞對順鉑的生存率；B：圖示不同GGA濃度（0 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1,000 μM）作用6 h后H446細胞對順鉑的生存率。Fig 4 Survival curves of SPCA-1 and H446 cells to cisplatin after being induced by GGA at different concentrations. A: Graph showing the survival curves of SPCA-1 cells to cisplatin after being induced by GGA at different concentrations (0 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1,000 μM) for 6 h; B: Graph showing the survival curves of H446 cells to cisplatin after being induced by GGA at different concentrations (0 μM, 10 μM, 50 μM,100 μM, 500 μM, 1,000 μM) for 6 h.

3 討論

化療耐藥是肺癌現(xiàn)階段治療中難以取得實質(zhì)性進展的主要障礙。肺癌的耐藥原因涉及多種機制，主要分為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥，前者表現(xiàn)為腫瘤細胞對化療藥物的天然不敏感，后者是腫瘤細胞因抗癌藥物誘導或其他因素的激活而產(chǎn)生的耐藥性。Hsps作為一種具有重要生理功能的應激蛋白，已經(jīng)成為腫瘤化療耐藥的研究熱點之一。Hsp90是家族重要成員，以“分子伴侶”的形式存在于細胞內(nèi)，溫度、蛋白錯誤折疊、感染和癌等各種應激因子可影響其合成[12]。Hsp90在應激條件下的高表達可維持細胞必需的蛋白質(zhì)空間構象，保護細胞的功能、生存和對應激原的耐受，是細胞的一種保護機制。研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，Hsp90與凋亡關系密切。Hsp90可以通過多種機制抑制細胞凋亡的發(fā)生。此外，很多研究通過抑制[11,16]及反義RNA[7]等多種方法均證實HSP90對細胞具有抗凋亡作用。

本研究通過GGA誘導肺癌SPCA-1及H446細胞中Hsp90的表達：當GGA濃度為10 μM-1,000 μM時，兩種細胞系中Hsp90蛋白水平的表達明顯升高，并與誘導劑的濃度呈現(xiàn)一定依賴性。GGA作為一種非毒性的誘導劑，無論是體內(nèi)還是在體外都能誘導Hsp70的表達[17-19]。國外的研究[20]發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細胞中，GGA同樣也可以誘導Hsp90的高表達，其機理可能是通過促使Hsp90與熱休克因子（human heat shock factor 1, HSF）的解離，導致多種HSF釋放并進入細胞核，使HSF1在胞漿內(nèi)以非DNA結合活性的單體形式游離出來，發(fā)生磷酸化后進入胞核，促進Hsp基因轉錄和翻譯過程，從而誘導Hsp90快速、過量表達。

研究[21-25]認為Hsp90在腫瘤細胞的存活過程中有非常重要的作用，已成為抗腫瘤治療的新靶點。但是，目前關于Hsp90與肺癌化療耐藥的研究還不多見，我們選取了臨床常用化療藥物順鉑及高發(fā)病率的人肺腺癌細胞作為本次研究對象。順鉑是周期非特異性藥物，它主要通過與DNA分子形成鏈內(nèi)或鏈間交叉聯(lián)接或阻止RNA分子再復制等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。結合國外已有的研究成果[11]，本研究主要應用不同濃度的GGA誘導后人肺癌細胞中Hsp90的表達，并采用有較高的臨床參考價值的Mヰ比色法[26-28]，分析Hsp90高表達在順鉑耐藥中的作用。結果表明：與對照組相比，兩種細胞系中，Hsp90高表達組（GGA誘導組）的細胞對順鉑的耐藥率增加，且與Hsp90表達水平呈正相關。即Hsp90高表達有助于肺癌細胞對化療藥物順鉑產(chǎn)生耐藥性。Hsp90上調(diào)引起腫瘤細胞耐藥性增加可能與如下的原因有關：Hsp90通過其受體多環(huán)節(jié)多途徑影響癌細胞生長和（或）存活。此外，Hsp90利用其與凋亡的密切關系[29]，啟動下游多種作用蛋白，參與調(diào)節(jié)不同的信號轉導通路，抑制凋亡的啟動，從而使細胞對化療藥物誘導的凋亡產(chǎn)生抗性[30]。該實驗結果對于指導臨床化療具有一定參考價值。

當然，肺癌細胞對化療藥物的耐藥是由多因素多機制共同作用的結果，細胞中Hsp90參與作用外，還有細胞自身對化療藥物的天然抗藥性，以及多藥耐藥蛋白等機制共同作用。因此，進一步研究Hsp90在肺癌耐藥中的表達規(guī)律及與預后關系，可能為臨床合理的治療提供一定的理論依據(jù)。