趙曉珍 吳中華 徐振曄 王中奇 吳繼 蘇婉

腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，而如何阻止與預(yù)防癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移更是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮組織被各種刺激誘發(fā)的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。在此過程中上皮細(xì)胞失去極性及細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間的粘附性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，獲得遷移與侵襲能力；而在癌化過程中，癌細(xì)胞通過具有鋅指結(jié)構(gòu)的Snail、Slug、Sip-1和具有螺旋-環(huán)狀-螺旋結(jié)構(gòu)的Twist與E-Cadherin啟動子部分的E-boxes相結(jié)合，導(dǎo)致如上皮細(xì)胞標(biāo)志因子E-Cadherin基因的失活和表達(dá)的下調(diào)，同時(shí)伴隨間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子Cadherin分子的轉(zhuǎn)化如N-Cadherin等。因此，EMT如果發(fā)生了就具備了轉(zhuǎn)移的特性，所以研究[1,2]認(rèn)為EMT是導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的導(dǎo)火線。

肺巖寧方是徐振曄教授領(lǐng)導(dǎo)科研課題組在三十余年的臨床實(shí)踐中總結(jié)出以益氣養(yǎng)精、解毒抗癌為治法，防治肺癌轉(zhuǎn)移的中藥復(fù)方，在臨床上取得良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的療效，使患者的生存期得到有效延長，生存質(zhì)量明顯得到改善[3-5]。

本課題組在以往的研究中成功構(gòu)建C57 Lewis肺轉(zhuǎn)移模型，實(shí)驗(yàn)[6,7]結(jié)果提示肺巖寧方具有明顯上調(diào)上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中上皮細(xì)胞標(biāo)志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin和下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子N-cadherin、Fibronectin的作用，說明在肺癌轉(zhuǎn)移的過程中伴隨著上皮-間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，而肺巖寧方在一定程度上可以調(diào)控EMT過程的發(fā)生。本研究將以人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95-D作為研究對象，進(jìn)一步研究肺巖寧方調(diào)控EMT的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑 人高轉(zhuǎn)移95D肺癌細(xì)胞，均由上海中科院細(xì)胞所提供。RPMI1640（GIBICO公司），新鮮小牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（華美生物制品公司），Trizol（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑（MBI公司），TaqDNA聚合酶及SYBR Green I熒光定量PCR試劑（大連寶生物工程公司），鼠抗人α-catenin抗體、鼠抗人β-catenin抗體、鼠抗人E-Cadherin抗體、鼠抗人Vimentin抗體、鼠抗人Fibronectin抗體、鼠抗人N-cadherin抗體均購買于Santa cruz。

1.2 藥物 肺巖寧方：由生黃芪、女貞子、蜂房、山慈菇、七葉一枝花、黃精等藥物組成。龍華醫(yī)院中藥房提供；順鉑（DDP）：20 mg/瓶，齊魯制藥廠產(chǎn)品，批號：0501003。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將人高轉(zhuǎn)移95D細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中（pH7.2-7.4），在37oC、5%CO2和飽和濕度條件下，細(xì)胞呈貼壁生長，待其鋪滿瓶時(shí)以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 肺巖寧方含藥血清的制備 雄性SD大鼠10只，隨機(jī)分為對照組和肺巖寧方組，每組5只，組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肺巖寧方組按體重灌胃給予肺巖寧方藥液（相對于人臨床用藥劑量的8倍），對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，2次/d，共3 d，最后一次給藥前禁食12 h（不禁水）。末次給藥后1 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉5 mL麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，立即注入無菌試管中，室溫靜置，待凝血堅(jiān)固，血清析出后，吸出上清離心處理（3,000 r/min，10 min，離心半徑為10 cm），取上清3 mL左右，同組血清混合，置于無菌試管中，56oC水浴中滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜除菌，分裝，密封，-20oC冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞密度調(diào)至1×106個(gè)/mL后均勻接種于96孔培養(yǎng)板中，6個(gè)復(fù)孔，置入37oC、5%CO2含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞生長旺盛時(shí)，離心去掉上清液，分別加入各組不同濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)依據(jù)含藥血清濃度由低到高分為5組，使其終濃度為體積分?jǐn)?shù)5%、 10%、15%、20%、25%，另設(shè)對照組DDP化療陽性對照組（2 μg/mL）和15%空白血清對照組，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞檢測。

1.6 Real-time PCR檢測各組細(xì)胞α-catenin、β-catenin、E-Cadherin、N-cadherin、Fibronectin、Vimentin RNA表達(dá)按照說明用Trizol等試劑從細(xì)胞中提取總RNA，以75%乙醇洗滌后再用DEPC處理水溶解RNA的制備：取各組的對數(shù)生長期細(xì)胞1×107個(gè)，加入1 mL Trizol勻漿后按照說明書提取總RNA，1 μL總RNA在20 μL體系中按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶采用M-MuLV。各基因mRNA拷貝數(shù)檢測采用實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體積為20 μL，其中含終濃度為200 nmol/L的上下游引物和2×的熒光標(biāo)記物SYBRGreen PCR Master Mix，擴(kuò)增反應(yīng)用SYBR Green I定量PCR試劑盒，各反應(yīng)管放入ABI-7300定量PCR儀。內(nèi)參選用GAPDH引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見表1。

1.7 Western blot方法檢測各組細(xì)胞α-catenin、β-catenin、E-Cadherin、 N-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白表達(dá)提取適量細(xì)胞中加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑，輕輕搖動5 min。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動15 min進(jìn)行裂解。上清液采用BCA蛋白定量，取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，膜封閉后加入多克隆抗體4oC過夜，然后加入相應(yīng)二抗后膜在將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育5 min。去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X光膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件，并用分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

1.8 數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析 基因表達(dá)采用2-△△ct法對實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行相對定量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇重復(fù)測量設(shè)計(jì)方差分析或單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)方法，采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表 1 各基因PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of different gene

2 結(jié)果

2.1 肺巖寧處理后人肺高轉(zhuǎn)移95-D細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin基因表達(dá)的影響與對照組相比，20%肺巖寧處理組α-catenin表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），20%、25%肺巖寧處理組E-Cadherin表達(dá)上調(diào)（P＜0.05, P＜0.01），而各肺巖寧處理組β-catenin的表達(dá)無明顯差異，陽性對照DDP組β-catenin表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）（圖1）。

2.2 肺巖寧處理后人肺高轉(zhuǎn)移95-D細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，5%、10%、15%、20%肺巖寧處理組E-Cadherin表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），而各肺巖寧處理組α-catenin、β-catenin的表達(dá)無明顯差異（圖2）。

2.3 肺巖寧處理后人肺高轉(zhuǎn)移95-D細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子N-cadherin、Fibronectin、Vimentin基因表達(dá)的影響 與對照組相比，5%、10%肺巖寧處理組Vimentin表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），而各肺巖寧處理組N-cadherin、Fibronectin的表達(dá)無明顯差異（圖3）。

2.4 肺巖寧處理后人肺高轉(zhuǎn)移95-D細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子N-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，5%、10%肺巖寧處理組N-cadherin、Fibronectin表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），而各肺巖寧處理組Vimentin的表達(dá)無明顯差異（圖4）。

圖 1 不同組別上皮細(xì)胞標(biāo)志因子α-catenin、β-catenin、E-Cadherin基因表達(dá)變化。直方圖顯示20%肺巖寧處理組α-catenin表達(dá)增加，20%、25%肺巖寧處理組E-Cadherin表達(dá)增加，DDP處理組β-catenin表達(dá)增加。Fig 1 The gene expression of epithelial cell markers α-catenin,β-catenin, E-Cadherin in different groups. The relative experssion of α-catenin mRNA was increased in 20% Feiyanning treated group;E-Cadherin mRNA were increased in 20% and 25% Feiyanning treated groups; β-catenin mRNA was increased in DDP chemotherapy group.

圖 2 不同組別上皮細(xì)胞標(biāo)志因子β-catenin、α-catenin、E-Cadherin蛋白表達(dá)變化。A：以actin為內(nèi)參照，上皮細(xì)胞標(biāo)志因子蛋白電泳圖；B：直方圖顯示5%、10%、15%、20%肺巖寧處理組E-Cadherin蛋白表達(dá)增加，各肺巖寧處理組中α-catenin、β-catenin表達(dá)無差別。Fig 2 The relative expression ofβ-catenin, α-catenin, E-Cadherin protein in different groups. A: actin as an internal reference, the figure of protein electrophoresis to the epithelial cell marker factor; B: The relative expressionof E-Cadherin protein were increased in 5%, 10%, 15%, 20% Feiyanning treated groups, and there was no difference for α-catenin, β-catenin in Feiyanning treated groups.

圖 3 不同組別間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子N-cadherin、Fibronectin、Vimentin基因表達(dá)變化。直方圖顯示5%、10%肺巖寧處理組Vimentin表達(dá)降低，各肺巖寧處理組中N-cadherin、Fibronectin表達(dá)無明顯變化。Fig 3 The gene expression of mesenchymal cell markers of N-cadherin,Fibronectin, Vimentin in different groups. The relative experssion of Vimentin mRNA were decreased in 5% and 10% Feiyanning treated groups, but there was no difference for N-cadherin and Fibronectin in Feiyanning treated groups.

圖 4 不同組別間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子N-cadherin、Fibronectin、蛋白表達(dá)變化。A：以actin為內(nèi)參照，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子蛋白電泳圖；B：直方圖顯示5%、10%肺巖寧處理組N-cadherin、Fibronectin蛋白表達(dá)下降，各肺巖寧處理組中Vimentin表達(dá)無明顯變化。Fig 4 The relative expression of N-cadherin, Fibronectin, Vimentin protein in different groups. A: actin as an internal reference, the figure of protein electrophoresis to the mesenchymal cell markers factor; B: The relative expression of N-cadherin and Fibronectin protein were deceased in 5% and 10% Feiyanning treated groups, but there was no difference for Vimentin in Feiyanning treated groups.

3 討論

醫(yī)學(xué)研究[8]表明，腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡和手術(shù)失敗的主要原因。所以明確腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理及進(jìn)一步研究抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物成為癌癥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。中醫(yī)藥抗腫瘤的研究主要方向之一即在于中藥方劑對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制上，我們課題組三十余年臨床探索認(rèn)為精氣兩虧是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一，采用益氣養(yǎng)精為主要治則的肺巖寧方即是在此理論指導(dǎo)下產(chǎn)生并被實(shí)踐證明有效的方劑。

EMT是指從具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)過程。研究[9,10]發(fā)現(xiàn)其不僅參與了胚胎的發(fā)育、組織的形成，而且參與了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

EMT發(fā)生過程中的重要性標(biāo)志就是E-Cadherin表達(dá)的減少和缺失。E-Cadherin是鈣粘蛋白家族的一個(gè)成員，它在維持上皮細(xì)胞的極性及增強(qiáng)細(xì)胞間的粘附中具有重要作用，它表達(dá)的減少可以導(dǎo)致細(xì)胞極性的消失和細(xì)胞粘附能力的下降，在多項(xiàng)研究[10-16]中已經(jīng)證實(shí)E-Cadherin的表達(dá)與腫瘤的侵襲能力成負(fù)相關(guān)，上皮細(xì)胞極性消失的同時(shí)伴隨著間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子Vimentin、N-cadherin、Fibronectin等表達(dá)的增加，從而促使EMT過程的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的開始。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以人肺癌高轉(zhuǎn)移95-D細(xì)胞為研究對象，和正常血清對照組相比，肺巖寧在mRNA和蛋白質(zhì)水平具有上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志因子E-Cadherin的作用；在mRNA水平具有下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志因子Vimentin的作用；在蛋白質(zhì)水平具有下調(diào)N-cadherin、Fibronectin的作用，而對上皮細(xì)胞標(biāo)志因子α-catenin、β-catenin卻無調(diào)控作用。由此我們認(rèn)為：①人高轉(zhuǎn)移肺癌95-D細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程的發(fā)生中伴隨著EMT標(biāo)志因子表達(dá)的改變；②中藥復(fù)方肺巖寧通過上調(diào)E-Cadherin、下調(diào)Vimentin、N-cadherin、Fibronectin的表達(dá)而達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用；③mRNA水平和蛋白質(zhì)水平肺巖寧調(diào)控的標(biāo)志因子存在差異；④肺巖寧方調(diào)控EMT過程的發(fā)生是多靶點(diǎn)的、多層次的。

因此，我們將在今后的研究中一方面圍繞調(diào)控EMT的信號途徑闡釋復(fù)方肺巖寧方抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理，另一方面以Vimentin為例，深入探討肺巖寧方在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平調(diào)控機(jī)制存在差異的原因。進(jìn)一步揭示中醫(yī)藥抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)理。