秦安東 周涯 盛美霞 費廣茹 任濤 徐林

MicroRNAs（miRNAs）是一組內源性、長約22 nt的非編碼小RNA，其主要在轉錄后水平通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結合，導致目的mRNA的降解或蛋白質翻譯抑制，而負調控目的基因的表達[1]。miRNAs參與細胞的分化、增殖、凋亡等多種生物學進程。近年來的研究[2,3]表明，miRNAs的突變和表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，可發(fā)揮癌基因和抑癌基因的作用，促進或抑制腫瘤的生長、侵襲和轉移。

肺癌是最常見的惡性腫瘤，高居惡性腫瘤死亡率的首位[4]。近年來，大量的研究[5-8]顯示，miRNAs與肺癌的生長、侵襲和轉移、預后相關。miR-155是miRNAs家族中的重要成員，有研究[8-10]報道，與正常肺組織相比，miR-155在肺癌組織中表達異常，與肺癌的預后相關。但目前關于miR-155與肺癌具體關系的研究還比較少。我們通過觀察體外轉染miR-155對人肺癌95D細胞體外生長的影響，探討其可能的作用機制，為進一步深入研究miR-155與肺癌的關系提供前期理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人源性肺巨細胞癌細胞株95D，購自中國科學院上海生化所。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基 （Hyclone）；優(yōu)質胎牛血清FBS（Solarbio）；hsa-miR-155 mimics、hsa-miR-155 mimics negative control（上海生工生物工程有限公司合成）；FuGENE? HD Transfection Reagent（Roche）；Trizol試劑（Invitrogen, USA）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）；TaqMan? MicroRNA Assay Kit（Ambion）；MTT試劑盒（Sigma）；兔抗人SOS1單克隆抗體、HRP標記羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology）；PI（propidium iodide）（Abcam）。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染 人肺癌95D細胞在含10%FBS（胎牛血清）、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、1 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640的培養(yǎng)基中，37oC、5%CO2全濕度培養(yǎng)。細胞轉染實驗分組：①空白對照組（Mock）：僅加入FuGENE? HD Transfection Reagent轉染試劑；②陰性對照組（miR-155 cont）：轉染miR-155 mimics negative control；③ miR-155轉染組 （miR-155）：轉染miR-155 mimics （40 pM, 80 pM, 160 pM）。轉染方法按照FuGENE?HD Transfection Reagent說明書操作。

1.4 RT-PCR檢測miR-155的表達 收集上述轉染48 h后的95D細胞，Trizol一步法提取總RNA，用miR-155發(fā)夾狀引物按試劑盒說明書操作逆轉錄合成cDNA；應用LightCycler（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,Germany）定量PCR儀對miR-155成熟體進行定量檢測。miR-155成熟體TaqMan探針由TaqMan? MicroRNA Assay Kit提供，PCR反應條件按試劑盒說明書操作。在擴增結束后將每對引物的擴增產(chǎn)物進行2%凝膠電泳分析，以確定擴增產(chǎn)物的特異性和靈敏度。miR-155成熟體相對表達水平計算：特異基因的DNA含量/內參GAPDH的含量=目的基因的相對表達水平。

1.5 MTT法檢測miR-155對95D細胞的增殖抑制 收集上述各實驗組細胞制備成單細胞懸液，調整濃度為（4-5）×105/mL接種于96孔培養(yǎng)板（200 μL/孔），每組細胞設10個平行孔。37oC、5%CO2培養(yǎng)72 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，待結晶物充分溶解后，酶標儀檢測570 nm處各孔OD值。

1.6 流式細胞術分析細胞周期分布 離心收集各組95D細胞，棄上清，用預冷PBS洗滌細胞兩次，加入預冷70%乙醇，于4oC固定過夜，PBS洗滌收集細胞，PBS重懸（1×106個/mL），吸取100 μL細胞懸液，加RNase A（100 μg/mL）和PI（50 μg/mL），4oC避光孵育30 min，PBS洗滌重懸后用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞周期的分布情況。

1.7 Western blot檢測SOS1蛋白的表達 收集各組細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白，Bradford法蛋白定量，進行SDS-PAGE電泳，將電泳分離的蛋白電轉移至PVDF膜上（14 V、80 min），5%脫脂牛奶封閉，加兔抗人SOS1單克隆抗體（1:200稀釋），4oC過夜，TBST洗3次，每次10 min。加入HRP標記的羊抗兔二抗（1:2,000稀釋），37oC，孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜3次，每次10 min，再用TBS洗膜1次，10 min，發(fā)光壓片顯色，以β-actin作為內參，分析結果。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 miR-155在95D細胞內的表達水平 為了檢測miR-155的轉染效率，轉染后48 h用實時熒光定量PCR對miR-155成熟體的表達進行檢測，結果顯示，與Mock組及miR-155 cont組比較，miR-155轉染組95D細胞miR-155的表達明顯增加（P＜0.05）（圖1），結果表明miR-155轉染效率良好。

2.2 miR-155轉染對95D細胞體外生長的影響 miR-155轉染48 h后，光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Mock組和miR-155 cont組細胞生長狀態(tài)良好，與Mock和miR-155 cont組相比，miR-155轉染組95D細胞的生長發(fā)生明顯變化：數(shù)目減少，細胞皺縮變圓，貼壁不牢，部分脫落（圖2A），且具有劑量依賴性，且結果顯示miR-155轉染劑量為80 pM和160 pM時，兩者對95D細胞生長的抑制作用無明顯差異，在后續(xù)的研究中均采用80 pM的劑量進行實驗。MTT結果也表明，與對照組相比，轉染miR-155能明顯抑制95D細胞的增殖（P＜0.05）（圖2B）。

圖 1 RT-PCR法檢測轉染后人肺癌95D細胞miR-155的相對表達水平Fig 1 Relative miR-155 expression in human lung cancer 95D cells transfected with miR-155 mimics detected by RT-PCR

圖 2 miR-155轉染對人肺癌細胞95D體外生長的影響。A：光學顯微鏡圖 （a: ×100; b: ×200; c: ×400）；B：MTT法檢測miR-155對人肺癌95D細胞增殖的抑制作用。Fig 2 The effects of miR-155 transfection on the growth of human lung cancer 95D cells in vitro. A: Observed under light microscope (a: ×100; b: ×200; c: ×400); B: Detected by MTT assay.

圖 3 miR-155轉染影響人肺癌95D細胞周期Fig 3 Effect of miR-155 over-expression on cell cyle profile in human lung cancer 95D cells

圖 4 miR-155轉染對人肺癌95D細胞SOS1表達的影響。A：TargetScan5.1軟件分析SOS1的3′UTR區(qū)域的hsa-miR-155的互補結合位點；B：miR-155轉染組與其它兩對照組的SOS1蛋白表達的Western blot印跡圖。Fig 4 Effect of miR-155 transfection on the expression of SOS1 in human lung cancer 95D cells. A: Complementarity site for miR-155 in the 3′UTR region of SOS1; B: The expression of SOS1 protein in human lung cancer 95D cell by Western blot.

2.3 miR-155轉染對95D細胞周期的影響 FACS檢測轉染組及對照組細胞周期的分布，結果顯示轉染miR-155的95D細胞G0/G1期細胞比例明顯增加，而S期比例則明顯減少，與Mock組和miR-155 cont組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3），結果表明上調miR-155的表達可以誘導95D細胞的G0/G1期阻滯。

2.4 miR-155轉染對人肺癌95D細胞中SOS1蛋白表達的影響 Western blot分析顯示，與兩個對照組比較，miR-155可以明顯抑制95D細胞中SOS1蛋白的表達（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

近年來，miRNAs與肺癌的發(fā)生、發(fā)展的關系已成為生命科學研究的熱點。與肺癌相關的多種miRNAs相繼被發(fā)現(xiàn)，Hayashita等[11]首先在肺癌中檢測出miR-17-92簇的過表達，特別是小細胞肺癌，這提示它很可能具有癌基因功能。隨后的研究[12]顯示，miR-17-92基因簇的成員miR-17-5p可通過抑制其靶基因Rb2的表達，從而促進肺上皮祖細胞的高度增殖和低分化，導致細胞的惡性變和肺癌的發(fā)生。Zhang等[13]研究表明，miR-21在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中明顯上調，通過與抑癌基因PTEN的3′UTR端結合，下調PTEN的表達，阻止其翻譯，促進腫瘤細胞的增殖。此外，Sun等[14]通過構建表達miR-126的質粒，轉染到NSCLC A549細胞系，發(fā)現(xiàn)無論在體內或體外miR-126的過表達均可下調EGFL7的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長。這些研究表明，miRNAs是肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要調控分子，具有癌基因或抑癌基因的作用。

miR-155位于BIC基因的第3個外顯子內，其表達水平受到BIC基因表達和miRNAs本身加工的調控[15]，miR-155是一種多功能的miRNA，其表達水平的變化與多種腫瘤密切相關。在血液系統(tǒng)腫瘤中，miR-155在多種B細胞淋巴瘤中過表達，在彌漫性大B細胞淋巴瘤中表達水平最高[16,17]。Jiang等[18]最近的研究表明miR-155通過負調控腫瘤抑制基因socs1，促進乳腺癌細胞的增殖，表現(xiàn)為癌基因的作用。目前，miR-155在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的確切功能和機制仍不清楚。我們在研究中采用體外轉染技術將miR-155轉染人肺癌95D細胞，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)miR-155能明顯抑制人肺癌95D細胞的體外增殖。而新近的研究[19,20]結果表明miR-155與NSCLC患者預后的相關性可能因肺癌的病理學類型而不同，在腺癌（adenocarcinomas, ACs）患者中，miR-155表達升高，預后較差；而對鱗癌（squamous cell carcinomas, SCCs）且伴淋巴結轉移的患者分析表明，miR-155表達升高，患者的5年生存率卻明顯增加[20]。此外，Volinia等[21]發(fā)現(xiàn)miR-155在胰腺癌中表達下調。Dorsett等[22]研究顯示miR-155能通過與Aicda的3′UTR 結合，下調AID（activation-induced cytidine deaminase）的表達及依賴AID的Myc-Igh易位發(fā)生的頻率，從而降低細胞癌變的風險。這些研究表明，miRNAs發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能可能因腫瘤的類型和病理學亞型不同而表現(xiàn)出功能的差異。FCM進一步分析顯示，miR-155能誘導人肺癌95D細胞G0/G1期阻滯。此前的多項研究也顯示miRNAs能調控肺癌細胞的細胞周期，Bandi等[23]發(fā)現(xiàn)上調miR-15a和miR-16的表達能將NSCLC細胞周期阻滯于G0/G1期。另一項研究[24]顯示，miR-107和miR-185可使肺癌H1299細胞和A549細胞停滯在G1期。

為了進一步探討miR-155對人肺癌95D細胞體外生長的抑制機制，我們采用TargetScan5.1篩選發(fā)現(xiàn)，SOS1的3′UTR具有與miR-155互補的序列，SOS1可能是miR-155的靶基因，SOS1是許多生長因子受體和粘附因子受體信號傳導的下游分子，是Ras信號途徑的一個重要分子，其活化能促進細胞的增殖和粘附。Timofeeva等[25]發(fā)現(xiàn)SOS1在前列腺癌中水平升高，下調前列腺癌細胞PC3和DU145中SOS1的表達，細胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯減弱。我們通過Western blot檢測轉染miR-155的人肺癌95D細胞SOS1表達水平，結果顯示轉染miR-155能明顯下調人肺癌95D細胞SOS1表達，通過研究分析，我們推測miR-155很可能通過下調SOS1的表達、誘導細胞周期阻滯對人肺癌95D細胞的體外生長發(fā)揮抑制作用，但是，miR-155對于肺癌生長的作用和機制有待進一步的研究。

總之，我們的研究表明miR-155可以明顯抑制人肺癌95D細胞的體外生長，這可能與與其抑制SOS1的表達和誘導細胞周期阻滯有關，為深入研究miR-155在肺癌細胞生長中的作用提供了前期的實驗依據(jù)，同時可為臨床肺癌生物治療提供新的靶點和方向。