馬飛 徐兵河 林東昕 孫瞳 石遠(yuǎn)凱

吉非替尼（gefitinib, ZD1839）是近年來(lái)腫瘤靶向治療成功的典范，屬于EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑，目前主要應(yīng)用于晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的臨床治療[1]。吉非替尼從研發(fā)到臨床應(yīng)用以來(lái)，藥物療效相關(guān)因素的研究就一直是熱門。研究[2]提示遺傳相關(guān)因素可能是影響吉非替尼療效的關(guān)鍵性因素。而單核苷酸多態(tài)性是最常見的遺傳變異形式，也是導(dǎo)致許多藥物療效個(gè)體差異的重要因素[3]。本課題組曾通過(guò)藥物靶標(biāo)基因-表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因的全基因篩選策略，發(fā)現(xiàn)EGFR基因rs2293347多態(tài)可能與吉非替尼的療效相關(guān)[4]，為此進(jìn)行了深入的臨床研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 用于單核苷酸多態(tài)性分析的病例均來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院2004年1月-2006年12月接受吉非替尼單藥治療的晚期NSCLC患者，共88例。所有患者均經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷，治療前均具有可測(cè)量的靶病灶。其中男性39例，女性49例，中位年齡56歲（34歲-76歲）?；颊逷S評(píng)分均為0分-1分，80.5%的患者為非吸煙者，80.5%的患者為腺癌，其余19.5%為鱗癌或大細(xì)胞癌。所有患者均接受了吉非替尼的單藥治療，其中47例為二線治療，41例為三線治療。均采用RECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)近期療效，1例患者達(dá)到完全緩解（complete response,CR），32例患者達(dá)到部分緩解（partial response, PR），21例患者接受吉非替尼治療后病情穩(wěn)定（stable disease,SD）超過(guò)24周，其余34例患者在治療24周內(nèi)出現(xiàn)病情進(jìn)展（progressive disease, PD），總體有效率為37.5%，將CR、PR、SD定義為吉非替尼治療有效（臨床獲益），PD患者定義為治療無(wú)效，臨床獲益率為61.4%。

1.2 rs2293347基因分型 采用PCR-RFLP（限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)）的方法進(jìn)行基因分型。分別采集所有患者抗凝外周靜脈血2 mL，酚-氯仿法提取模板DNA。采用PCR的方法擴(kuò)增EGFR基因第25外顯子片段，PCR反應(yīng)的引物分別為5’-ATGAGGTACTCGTCGGCATC-3’和5’-GAACCAAGGGGGATTTCATT-3’，產(chǎn)物大小為244 bp。25 μL PCR混合液中含0.1 μg模板DNA，引物濃度0.4 μmol/L，擴(kuò)增條件為：95oC預(yù)變性2 min后，于94oC 30 s、60oC 30 s和72oC 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72oC延伸7 min。PCR產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶Tfi I進(jìn)行酶切，酶切溫度60oC，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，讀取基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有資料應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，rs2293347基因型與臨床特征及近期療效關(guān)系的分析采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs2293347基因分型結(jié)果 采用PCR- RFLP法對(duì)88例晚期NSCLC患者的外周血DNA進(jìn)行了rs2293347基因分型。其中GG基因型63例，占71.6%；GA基因型24例，AA基因型1例，GA/AA基因型占28.4%。

2.2 rs2293347基因型與患者臨床病理特征及吉非替尼近期療效的關(guān)系 在88例接受吉非替尼單藥治療的晚期NSCLC患者中，將rs2293347不同基因型與患者臨床病理特征以及吉非替尼的近期療效進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶GG基因型的63例患者中，CR 1例（1.6%），PR 28例（44.4%），SD 16例（25.4%），PD 18例（28.6%），臨床獲益率為71.4%；攜帶AA基因型患者僅為1例，吉非替尼的臨床療效為PD；攜帶GA基因型患者為24例，其中PR 4例（16.7%），SD 5例（20.8%），PD 15例（62.5%），臨床獲益率僅為37.5%；攜帶GA/AA基因型患者臨床獲益率為36.0%。所有治療有效的患者中，GG基因型占83.3%，GA/AA基因型占16.7%；所有治療無(wú)效的患者中，GG基因型占52.9%，GA/AA基因型占47.1%。rs2293347基因型與吉非替尼的近期療效密切相關(guān)（P=0.002），但是與患者的年齡、性別、PS評(píng)分、吸煙狀況和病理類型均無(wú)明顯相關(guān)性（表1）。

2.3 rs2293347不同基因型患者的預(yù)后 rs2293347 GG基因型NSCLC患者經(jīng)吉非替尼治療后，中位無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival, PFS）為10個(gè)月，而rs2293347 GA/AA基因型患者的中位PFS為3個(gè)月，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.005）。GG基因型患者的中位總生存期（overall survival, OS）也比GA/AA基因型患者長(zhǎng)（22個(gè)月vs 14個(gè)月），但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.409）。

3 討論

分子靶向治療是近年腫瘤治療學(xué)領(lǐng)域新的里程碑，特異性抑制腫瘤細(xì)胞是分子靶向治療區(qū)別于傳統(tǒng)化療藥物的關(guān)鍵性特征，也正是這一特征，使得靶向治療適應(yīng)人群的選擇性遠(yuǎn)比傳統(tǒng)化療要嚴(yán)格。另外，目前靶向治療藥物十分昂貴，盲目地濫用靶向藥物是對(duì)醫(yī)療資源的極大浪費(fèi)，這也要求靶向治療只能選擇性地應(yīng)用于少數(shù)最可能獲益的患者人群。因此，如何預(yù)測(cè)分子靶向治療的療效以及選擇最可能獲益的目標(biāo)人群，成為當(dāng)前腫瘤靶向治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵性臨床問(wèn)題。

在吉非替尼的臨床實(shí)踐中，探尋療效預(yù)測(cè)指標(biāo)一直是研究熱點(diǎn)。目前認(rèn)為亞裔、女性、腺癌或無(wú)吸煙史的NSCLC患者往往對(duì)吉非替尼比較敏感[5]；EGFR的表達(dá)、酪氨酸激酶活性以及EGFR下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也可能影響了藥物的敏感性[6]。另外，EGFR基因的突變與吉非替尼敏感性密切相關(guān)[7]。

表 1 88例吉非替尼治療患者臨床特征與EGFR基因rs2293347基因型的統(tǒng)計(jì)分析Tab 1 Stratification analysis of EGFR rs2293347 genotypes and clinical characteristics in 88 NSCLC patients treated with gefitinib

以上藥物療效相關(guān)因素研究中，不同研究者得到的結(jié)論不盡一致，甚至有些研究結(jié)論互相矛盾[1,8-10]，因此這些指標(biāo)在臨床應(yīng)用于預(yù)測(cè)吉非替尼藥物療效前還需要更為大宗的臨床研究加以證實(shí)。此外以上指標(biāo)并不能全面解釋吉非替尼療效的個(gè)體差異。其它一些指標(biāo)的檢測(cè)例如突變，操作煩瑣、費(fèi)用昂貴、腫瘤組織來(lái)源困難，均限制了其臨床廣泛應(yīng)用。因此，尋找簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確性高的吉非替尼療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)于指導(dǎo)NSCLC合理的個(gè)體化分子靶向治療具有重大的臨床意義。

目前研究提示遺傳變異主要為基因多態(tài)性可能是吉非替尼藥物療效差異的主要來(lái)源。本研究組前期曾開展了吉非替尼療效相關(guān)的多態(tài)性研究[11]，主要集中在重復(fù)序列數(shù)目差異（VNTR）。對(duì)NSCLC患者EGFR基因第1內(nèi)含子區(qū)CA雙核苷酸單序列重復(fù)（CA-SSR）多態(tài)性進(jìn)行了基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶短CA重復(fù)序列的患者吉非替尼的近期有效率明顯高于攜帶長(zhǎng)重復(fù)序列的患者，但是CA-SSR多態(tài)性并不能影響吉非替尼治療后患者的無(wú)進(jìn)展生存和總生存情況。

在人類基因組中數(shù)量龐大的單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism, SNP）才是個(gè)體間遺傳差異的主要來(lái)源。借助于高密度SNP圖譜的繪制和高通量基因分型技術(shù)的發(fā)展[12,13]，我們?cè)槍?duì)藥物靶標(biāo)開展了全基因功能性SNP篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR基因SNP位點(diǎn)rs2293347的基因型與吉非替尼的臨床療效可能相關(guān)[4]。本研究進(jìn)一步確定了這種相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)rs2293347還與患者的無(wú)進(jìn)展生存密切相關(guān)。rs2293347作為同義SNP，位于EGFR基因第25外顯子這一功能活性區(qū)，但是并沒(méi)有導(dǎo)致EGFR受體氨基酸的改變（D994D）。雖然許多同義SNP也可影響mRNA穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄或剪切，從而影響蛋白表達(dá)、結(jié)構(gòu)或功能[14-16]。但是rs2293347是否通過(guò)影響EGFR受體功能而對(duì)吉非替尼療效產(chǎn)生影響，確切的機(jī)制也有待于進(jìn)一步的研究。

另外，SNP作為遺傳標(biāo)記物預(yù)測(cè)吉非替尼的療效，在某些方面具有優(yōu)于傳統(tǒng)預(yù)測(cè)指標(biāo)（EGFR基因突變）的優(yōu)勢(shì)。目前臨床上能夠獲得基因突變檢測(cè)標(biāo)本的患者僅約20%（來(lái)自ISEL研究的數(shù)據(jù)）[17]，而所有患者均可以獲得SNP檢測(cè)的外周血標(biāo)本，并且SNP檢測(cè)流程相對(duì)簡(jiǎn)便、成本低廉。當(dāng)然，rs2293347能否最終應(yīng)用于臨床，補(bǔ)充甚至替代現(xiàn)有療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，還有待大宗的前瞻性臨床研究證實(shí)。