楊帆 陳克終 姜冠潮 李劍鋒 王俊

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor,TKI）的出現(xiàn)是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治療領域的重大突破。現(xiàn)已確認，腫瘤攜帶特定的EGFR基因突變是藥物療效的可靠預測指標。因此基因突變檢測具有非常重要的臨床意義。

檢測EGFR基因突變的方法很多，但絕大多數(shù)都需要使用諸如測序儀、實時定量聚合酶鏈式反應儀、高效液相層析等昂貴的設備，或十分復雜的方法（如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，核酸肽鎖核酸法等），難以在醫(yī)院的普通實驗條件下開展。本研究旨在建立使用常規(guī)實驗儀器、高靈敏度、簡便的檢測EGFR突變方法，以利于國內(nèi)推廣EGFR基因突變檢測。

1 材料與方法

1.1 肺癌標本 選取北京大學人民醫(yī)院保存、經(jīng)病理證實的肺腺癌手術標本251例，其中231例為新鮮凍存標本，另20例為福爾馬林固定的石蠟包埋標本。其中男性135例，女性116例。平均年齡62.1歲（33歲-82歲），吸煙者103例，不吸煙者148例。I期52例，II期45例，III期98例，IV期56例。

1.2 標本DNA提取 凍存標本取100 mg，機械研磨。石蠟包埋標本取10 μm切片5張，刮入EP管中，以二甲苯脫蠟2次后梯度乙醇水化。DNA提取試劑盒采用天根生化（科技）公司的TIANamp Micro DNA Kit試劑盒，依據(jù)廠家提供的說明進行。

1.3 EGFR突變檢測 方法改良自Asano等[1]的方法。原理是標本DNA首先經(jīng)過特異性消化野生型EGFR基因的限制性內(nèi)切酶切割，再進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）擴增。因絕大部分野生型基因已斷裂無法作為PCR反應模板，使得擴增產(chǎn)物中突變型基因的比例大大增加。19號外顯子缺失突變的鑒定通過PCR產(chǎn)物電泳圖中存在較野生型更短的片段（117 bp-108 bp）完成；21號突變鑒定采用特異性切割L858R突變的內(nèi)切酶二次消化，以存在可被二次消化的PCR產(chǎn)物判定突變（圖1）。具體步驟如下：

1.3.1 EGFR外顯子19突變檢測方法 標本DNA中加入Mse I內(nèi)切酶2 IU（Fermentas公司），反應體系20 μL，37oC酶切4 h，65oC滅活。PCR反應在同管內(nèi)進行。再加入上下游引物各2 μL、Taq酶（Invitrogen公司）、dNTP、不含鎂離子緩沖液及雙蒸水至50 uL。上游引物序列5’-AGG GAC TCT GGA TCC CAG AAG GTG-3’，下游引物5’-CCC ACA CAG CAA AGC AGA AAC TCAC-3’。變性94oC、退火60oC、延長72oC，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物鑒定采用12%聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下照相。酶切及PCR反應均在PCR儀上完成。

1.3.2 EGFR外顯子21突變檢測方法 限制性內(nèi)切酶消化野生型EGFR基因、PCR擴增條件與上一方法相同，內(nèi)切酶使用Msc I（Fermentas公司）。PCR上游引物序列5’-CAG CCA GGA ACG TAC TGG TGA-3’，下游引物5’-TCC CTG GTG TCA GGA AAA TGC T-3’。反應條件與上一方法相同。PCR結(jié)束后仍在原管中進行第二輪酶切：加入內(nèi)切酶Sau96 I 10IU（Fermentas公司），加緩沖液及雙蒸水至體系60 μL。37oC酶切4 h，PCR產(chǎn)物鑒定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳與上一方法相同。

1.4 檢測靈敏度（閾值）鑒定 將野生型EGFR基因的A549細胞（本實驗室保存）與攜帶外顯子19缺失突變HCC827人肺癌細胞（購自美國模式培養(yǎng)物集存庫），或21號外顯子L858R突變H1975細胞（購自中國醫(yī)學科學院細胞庫），根據(jù)報道[2,3]的EGFR基因拷貝數(shù)3.4、36.0和3進行系列稀釋后，提取基因組DNA，使得其中突變型與野生型EGFR基因的比例分別為：1:1、1:10、1:20、1:50、1:100、1:200、1:400和1:1,000。分別按上述檢測方法進行基因突變的檢測。

1.5 測序 所有采用內(nèi)切酶法檢測的標本DNA采用相同引物進行35個循環(huán)PCR擴增，50 μL體系，反應條件同前。擴增產(chǎn)物送華大基因公司進行上、下游引物雙向測序。序列分析采用Mutation Surveyor軟件。

2 結(jié)果

2.1 采用優(yōu)化的內(nèi)切酶富集法檢測251例標本與直接測序法檢測結(jié)果相比較 相同的251例標本DNA，采用直接測序，檢測到外顯子19和21突變72例，突變率28.7%，采用本研究的內(nèi)切酶法檢測到135例，突變率53.8%，所有測序法發(fā)現(xiàn)的突變均檢測到之外，又檢測到突變63例（表1）。

2.2 靈敏度測試 當突變型基因與野生型EGFR基因比例大于1：200時（0.5%）時，即可見到突變的特異性條帶，表明檢測閾值為0.5%（突變型/野生型基因）。PCR產(chǎn)物電泳圖見圖2。

3 討論

EGFR TKI的出現(xiàn)為晚期NSCLC提供了全新的治療途徑。研究[4]發(fā)現(xiàn)，EGFR TKI的療效與腫瘤細胞中攜帶著特定EGFR基因突變顯著相關，特別是占全部突變約90%的外顯子19缺失突變和外顯子21的L858R點突變，有效率達70%以上，反之則極少有效。因此，EGFR突變的檢測成為了臨床用藥的重要參考指標。隨著吉非替尼和紫杉醇/卡鉑一線治療對比的IPASS研究[5]和西班牙厄洛替尼一、二線治療研究[6]的發(fā)表，EGFR TKI甚至成為了攜帶EGFR突變的晚期患者的一線治療，徹底打亂了原有的傳統(tǒng)化療流程，同時也把EGFR突變檢測的重要性提升到了前所未有的高度。

表 1 標本EGFR基因突變檢測測序法與內(nèi)切酶法結(jié)果比較Tab 1 Comparison of modified restriction enzyme-based detection and direct sequencing for EGFR mutation

圖 1 內(nèi)切酶突變富集法原理圖（黑色橫線代表野生型EGFR基因片段，紅色代表突變型片段）。A：外顯子19突變檢測；B：外顯子21突變檢測。Fig 1 Enzyme-based enriched method(Black line represent wild EGFR gene segment, red line represent mutant EGFR gene segment). A: exon 19; B: exon 21.

圖 2 內(nèi)切酶突變富集法靈敏度測試。A：外顯子19；B：外顯子21。Fig 2 Sensativity measurement of modified restriction enzyme-based enriched method. A:Exon 19; B: Exon 21.

最初采用的EGFR突變檢測方法是PCR擴增后的直接測序，因為能夠直接鑒定突變的類型，測序法也成為了金標準。但是，這種方法的靈敏度不高，要求腫瘤細胞在標本中的比例要大于25%[7]，但臨床標本取材也往往混雜大量的正常細胞背景。為保證測試的準確性，美國EGFR檢測協(xié)作組建議標本必須在病理科醫(yī)師的協(xié)助下選取石蠟切片中腫瘤細胞50%-70%區(qū)域進行細胞富集[8]。

除測序法外，將近十余種的檢測方法被設計出來，目的是靈敏、準確的檢測到突變[9]。包括實時定量聚合酶鏈式反應（TaqMan）法[10]、變性高效液相層析（DHPLC）[11]、高分辨溶解曲線分析[12]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）[13]、核酸肽鎖核酸法[14]、雜交環(huán)電泳率分析法[15]、擴增受阻突變體系（ARMS）[16]等。這些方法或需要昂貴的設備，或采用步驟繁瑣對實驗條件要求很高，難以在常規(guī)實驗條件下開展。相比之下本研究的方法簡單易行，除普通PCR儀和凝膠電泳設備外無需其它昂貴設備，而且檢測閾值達到0.5%（表2）。

表 2 各種EGFR基因突變檢測方法的比較Tab 2 Comparison of the detection methods of EGFR gene mutations

對于所有建立在PCR反應上的檢測方法，盡可能避免污染是關鍵。除嚴格設定陰性、陽性對照，分區(qū)進行PCR反應和電泳外，本研究改良的主要工作就是簡化步驟、減少污染可能。首先，原方法采用了二輪PCR擴增的方法，雖然靈敏度極高，可檢測出0.5‰（1:2,000）的攜帶突變的細胞[1]，但步驟繁瑣，需要對PCR產(chǎn)物進行純化、酶切，大大增加了污染的機會。本研究把PCR擴增減少到一輪。測試表明，改良的方法仍可以保持0.5%的檢測閾值，滿足檢測的要求。其次針對PCR容易產(chǎn)生污染的問題，通過優(yōu)化反應條件，主要是匹配各步驟的離子強度，將所有反應盡可能在同一個PCR管中完成，不斷加入試劑。僅在進行電泳時涉及移出PCR產(chǎn)物，對于外顯子21的點突變檢測，由于只有L858R突變體已被酶切，其對后續(xù)標本的污染可能性非常小。

我們在256例腺癌中共檢測出EGFR外顯子19突變78例，外顯子21突變57例，突變率53.8%，與IPASS研究中采用ARMS方法檢測的外顯子19和21的突變率57.4%類似[6]。相同的DNA標本采用測序法和新方法檢測對比，本研究優(yōu)化的內(nèi)切酶富集法靈敏，沒有漏檢，卻相比直接測序多檢測到將更多的突變（53.8% vs 28.7%）。由于本實驗的方法較測序法更加靈敏，因此新方法的特異性和準確性無法得到驗證，僅能通過與IPASS研究中檢測結(jié)果對比間接表明結(jié)果可信，這是本研究的不足之處。此外，本方法無法檢測18、20外顯子等其它罕見突變，也是其局限性所在。另外需要指出的是本研究使用的標本沒有經(jīng)過病理科醫(yī)師的選擇，腫瘤細胞比例很可能達不到美國EGFR檢測協(xié)作組建議的標準。采用這種“不達標”標本的目的是比較測序法和改良突變富集法的靈敏度，測序法出現(xiàn)假陰性不但不能否定測序，反而更強調(diào)了美國EGFR檢測協(xié)作組建議的重要性。

綜上，本研究優(yōu)化了新的肺癌標本中EGFR基因突變檢測方法，其最大優(yōu)勢在于不需要特殊的昂貴儀器，且具體的實驗技術較簡單，耗時短，試劑簡單費用低。這對于國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院而言，都具有可操作性，有推廣的價值。