王紅梅 戴紀(jì)剛

線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器，作為細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，它在細(xì)胞的能量代謝和氧自由基生成過程中扮演重要角色。同時(shí)，線粒體也是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵元件，這些細(xì)胞器收集并處理有關(guān)細(xì)胞代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)各方面的信號(hào)，決定著細(xì)胞的命運(yùn)，參與了細(xì)胞死亡的執(zhí)行過程。能量代謝模式的轉(zhuǎn)換是癌細(xì)胞的重要特征。細(xì)胞在癌變過程中，將線粒體關(guān)閉，能量來源轉(zhuǎn)換為糖原酵解模式，同時(shí)線粒體啟動(dòng)異常細(xì)胞凋亡的作用消失，這些細(xì)胞就可能“永生化”及癌變。線粒體DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）含量（即拷貝數(shù)）及氧化磷酸化相關(guān)酶活性的降低是腫瘤能量代謝發(fā)生改變的主要原因。為了解非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）組織中mtDNA的拷貝數(shù)是否發(fā)生改變并探討mtDNA拷貝數(shù)改變與NSCLC的相關(guān)性，本研究通過兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)肺癌及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織mtDNA的含量進(jìn)行了精確定量（拷貝數(shù)/細(xì)胞）。

1 材料與方法

1.1 病例資料 所用37例肺癌組織和37例癌旁肺組織均取自第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院2006年-2008年外科手術(shù)患者，均經(jīng)病理確診。癌旁肺組織標(biāo)本為同一患者病灶遠(yuǎn)端5 cm以上的正常肺組織，均經(jīng)組織學(xué)診斷，證實(shí)其沒有癌細(xì)胞。本組患者男性28例，女性9例，吸煙及曾經(jīng)吸煙者24例（吸煙者：每天吸煙10支以上且吸煙時(shí)間超過1年。本組中包括曾經(jīng)吸煙而現(xiàn)戒煙1年以上者9例），不吸煙者13例?；颊吣挲g30歲-75歲，中位年齡為55歲。組織學(xué)病理分型情況為：鱗癌23例，腺癌14例。

1.2 組織全基因組DNA提取 采用酚、氯仿、異戊醇抽提法提取全基因組DNA（包括mtDNA）。所得DNA溶于TE buffer（10 mM Tris±HCl, 1 mM EDTA, pH8.0），并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其波長260 nm時(shí)的吸光度（ OD260nm）值，計(jì)算DNA 濃度，-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR引物及TaqMan探針 所有引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成、標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的熒光檢測(cè)物質(zhì)有FAM（6-Carboxy-fluorescein）和TAMRA（6-Carboxytetramethy-rhodamine），其中FAM作為報(bào)告基因（Reporter），標(biāo)記在TaqMan探針的5'。TAMRA作為熄滅基因（Q uencdher），標(biāo)記在TaqMan探針的3'。TaqMan探針與目的基因的結(jié)合部位在兩個(gè)引物之間。用于擴(kuò)增人mtDNA D-loop HV1（Hipervariable region 1, HV1）和核β-globin基因的引物及TaqMan探針見表1。

1.4 線粒體HV1和核β-globin基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.4.1.1 HV1和β-globin基因片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25 μL，終濃度為：Taq酶2 U，MgCl22.5 mmol/L，dNTP各200 μmol/L，引物各0.5 μmol/L，模板DNA約100 ng 。反應(yīng)條件：94oC預(yù)變性5 min，其余40個(gè)循環(huán)94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、1 min，最后72oC延伸10 min。

1.4.1.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆 用TaKaRa公司的試劑盒對(duì)PCR樣品進(jìn)行純化后，分別將128 bp HV1和110 bp β-globin擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體（TaKaRa公司），篩選含有插入片段的載體，以JM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN公司）提取質(zhì)粒。

1.4.1.3 質(zhì)粒的鑒定與測(cè)序 將部分所提取的質(zhì)粒經(jīng)過PCR和序列測(cè)定進(jìn)行鑒定，測(cè)序反應(yīng)由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成 。

1.4.1.4 質(zhì)粒濃度測(cè)定及拷貝數(shù)換算 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其OD260值。質(zhì)粒濃度（ng/μL）=OD260×50 μg/mL×稀釋終體積（mL）×1,000/稀釋時(shí)加入的原始溶液體積（μL）。質(zhì)?？截悢?shù)（Copies/μL）=質(zhì)粒濃度（ng/μL）×6.02×1014/660×堿基數(shù)（載體+插入片段）。

1.4.1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋 以無菌去離子水10倍比梯度稀釋HV1和β-globin質(zhì)粒分別獲得濃度為1×103-1×107拷貝/μL的制備定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.4.2.1 PCR反應(yīng) 25 μL體系中含ABI TaqMan 1×PCR Master mix、3.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP、引物各0.5 μmol/L、熒光探針50 nmol/L、模板各2.0 μL 。每次檢測(cè)設(shè)置3個(gè)NTC（no template control）。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行樣實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.2 PCR反應(yīng)條件 50oC、2 min，95oC、10 min；然后95oC、15 s，60oC、30 s，共50個(gè)循環(huán)。TaqMan PCR Core試劑盒、光學(xué)PCR管、7700型PCR儀均為PE公司產(chǎn)品。

1.4.2.3 HV1和β-globin標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2.4 mtDNA拷貝數(shù)的檢測(cè) 通過兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別對(duì)待測(cè)樣本中線粒體HV1和核β-globin基因進(jìn)行定量。以mtDNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數(shù)的標(biāo)記。mtDNA的含量，即相對(duì)拷貝數(shù)/二倍體核基因組（diploid nuclear genome）=2×HV1/β-globin[1]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以Mean±SD表示，使用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和線性回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 克隆質(zhì)粒的鑒定 提取經(jīng)篩選的用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的質(zhì)粒，經(jīng)過PCR及序列測(cè)定證實(shí)，HV1和β-globin基因PCR片段已分別連接至PMD18-T載體上，并用所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，可見有明顯的熒光信號(hào)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（threshold cycle,Ct）值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。不同濃度標(biāo)準(zhǔn)定量的模板與Ct值呈直線相關(guān)。HV1和β-globin基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999，斜率分別為-3.159和-3.400。

2.3 肺癌mtDNA拷貝數(shù)的改變 為了解肺癌組織中mtDNA含量的改變，我們通過兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)肺癌及相對(duì)應(yīng)的癌旁肺組織mtDNA含量進(jìn)行了精確定量（拷貝數(shù)/細(xì)胞）。線性回歸分析表明，肺組織mtDNA拷貝數(shù)和相對(duì)應(yīng)的正常肺組織mtDNA拷貝數(shù)之間有相關(guān)性（r=0.589, P＜0.01）（圖2）。肺癌組織mtDNA的平均拷貝數(shù)/細(xì)胞為395±125，而相對(duì)應(yīng)的正常肺組織為733±196，前者明顯低于后者（P＜0.001）。

2.4 肺癌mtDNA拷貝數(shù)改變和臨床指標(biāo)的相關(guān)性 根據(jù)患者性別、年齡、是否吸煙、病理類型，我們將37例樣本進(jìn)行分組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，肺癌mtDNA拷貝數(shù)的改變與患者性別、年齡、是否吸煙及腫瘤的病理類型無關(guān)（P＞0.05）（表 2）。

)t (bp uc prod CR 0 8 of P 1112 th ng Le AT CA CTG CT GC CC AG GA GT)TT TA'-3'TG TC TA AC CA TT GTAC ATAC GA(5AG TC CG AA GT ce GA GT CA GC AA ATAA GT AT uct en GA AG GT CT TC CA CC TA TG prod qu Se TG TT TTAC GT CC AA AC AC GC GG AC CA CR CT AC CA AT TG of P CC GC CC TT GT GA th CT ng le nd nce a e am rr rr ue e n prob e rime rime e rime rime針prob e seq nd er a Prob ard p rw rse p ve Prob ard p rw rse p ve探an Prim Fo Re Fo Re an qM qM Ta Ta和列er a nd序in 1 引物Prim et表Ta b 1rg Ta β-glob 1 HV

圖1 mtDNA HV1（圖1A，圖1B）和核基因（圖1C，圖1D）實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)力曲線圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Amplification plots and standard curves of real-time PCR for Mitochondrial DNA HV1 (Fig 1A,Fig 1B) and nuclear β-globin gene (Fig 1C, Fig 1D)

圖2 肺癌及相對(duì)應(yīng)的癌旁肺組織mtDNA 拷貝數(shù)散點(diǎn)圖及線性相關(guān)分析Fig 2 MtDNA copy number in lung cancinoma and adjacent nomal samples

表2 肺癌線粒體DNA拷貝數(shù)的改變和臨床指標(biāo)的關(guān)系Tab 2 MtDNA copy number per nucleus in relation to clinicopathological variables in lung cancer

3 討論

哺乳動(dòng)物mtDNA是一全長為16.5 kb左右的雙鏈閉環(huán)分子。它含有37個(gè)基因和一個(gè)非編碼區(qū)（控制區(qū)），非編碼區(qū)又稱之為D環(huán)（displace loop, D-loop），其內(nèi)有控制mtDNA轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)序列。人類mtDNA D-loop的起始和結(jié)束位置分別為mtDNA的16,023和576核苷酸處，長度為1,122 bp。mtDNA兩條互補(bǔ)鏈的堿基組成呈非對(duì)稱性。一條鏈稱重鏈，富含G堿基，編碼37個(gè)線粒體基因中的28個(gè)。另一條鏈稱輕鏈，G堿基較少，編碼其余的線粒體基因。與核不同的是，線粒體基因組為多拷貝基因組。體細(xì)胞中平均含有100個(gè)-500個(gè)線粒體，而每一個(gè)線粒體中又含有1個(gè)-15個(gè)mtDNA分子。呼吸鏈的正常組合和運(yùn)轉(zhuǎn)需要一個(gè)完整和功能性的線粒體基因組，而mtDNA功能的完成既依賴于每一個(gè)mtDNA分子結(jié)構(gòu)的完整性，也同時(shí)依賴于細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)。

大多數(shù)實(shí)體性腫瘤中，能量代謝的改變和mtDNA含量有著密切的聯(lián)系。Meierhofer等[1]研究表明腎癌組織中mtDNA含量和酶活性顯著低于癌旁組織，并且兩者的下調(diào)呈一致性。Mambo等[2,3]發(fā)現(xiàn)80%的乳腺癌組織其mtDNA拷貝數(shù)低于相應(yīng)的正常組織。研究[4]表明線粒體酶活性的降低與腫瘤的類型和分化程度密切相關(guān)。目前還在肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤及腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)存在有mtDNA含量的降低[5]。在本研究中，我們對(duì)NSCLC及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常肺組織mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)行了精確定量（拷貝數(shù)/細(xì)胞），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組織mtDNA的平均拷貝數(shù)/細(xì)胞低于相對(duì)應(yīng)的癌旁正常肺組織。但我們并沒有觀察到mtDNA拷貝數(shù)的改變與患者性別、年齡、是否吸煙及腫瘤的病理類型之間的相關(guān)性。由此我們可以推論，mtDNA拷貝數(shù)量的改變與NSCLC的發(fā)生有密切關(guān)系，與患者性別、年齡、是否吸煙等因素?zé)o關(guān)；但NSCLC與小細(xì)胞肺癌之間是否有差異性則無法判斷。這與Matthew等[6]的研究結(jié)果具有一致性。

研究表明腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)，而線粒體途徑是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑之一。一些環(huán)境因素的改變或者有害物質(zhì)的入侵，可造成線粒體腫脹破裂或多個(gè)線粒體融合成一個(gè)大線粒體，影響呼吸鏈電子傳遞，造成細(xì)胞死亡。這些都表明線粒體在腫瘤的發(fā)生過程中具有重要作用。我們檢測(cè)到肺癌組織中mtDNA的含量低于癌旁正常組織，表明mtDNA拷貝數(shù)降低可能導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡減少，從而促進(jìn)了肺癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。

由于腫瘤細(xì)胞線粒體在分子、生化、代謝和遺傳水平上明顯區(qū)別于正常細(xì)胞，惡性腫瘤組織氧化抑制抑制酵解的現(xiàn)象減弱甚至消失，而代之以酵解抑制氧化，此即Crabtree效應(yīng)。我們實(shí)驗(yàn)測(cè)得正常肺組織mtDNA平均拷貝數(shù)/細(xì)胞為733±196，低于骨骼肌細(xì)胞中的1,811±546[7]和心肌細(xì)胞中的6,970±920拷貝數(shù)/細(xì)胞[8]，這與肺組織細(xì)胞能量代謝和有氧ATP生產(chǎn)的需求低于骨骼肌和心肌細(xì)胞的特點(diǎn)是一致的。臨床研究調(diào)查表明肺腫瘤的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于骨骼肌和心肌腫瘤的發(fā)病率。由此我們可以推論，mtDNA含量低的組織細(xì)胞更易適應(yīng)糖酵解供能的生長模式，從而發(fā)生腫瘤的幾率更高。

研究[9]發(fā)現(xiàn)線粒體特異性的抑制劑處理和mtDNA的部分減損，可通過某個(gè)應(yīng)激信號(hào)而誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞系出現(xiàn)侵襲性腫瘤表型；mtDNA缺失細(xì)胞系HeLa rho0細(xì)胞對(duì)阿霉素和光動(dòng)力性療法（photodynamic therapy）誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有極端的耐受性，而HeLa rho+細(xì)胞卻非常敏感[10-12]；這表明mtDNA含量降低不僅與惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，還關(guān)系到腫瘤的治療和預(yù)后，NSCLC中mtDNA含量較低可能是其化療敏感性差的原因之一。

目前我們的研究結(jié)果表明mtDNA含量降低可能與NSCLC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、治療和預(yù)后具有密切關(guān)系。但引起這一變化的原因和具體機(jī)制還不清楚。我們將進(jìn)一步探索研究，以期能為NSCLC的治療提供更多理論基礎(chǔ)。