金李君 浙江省人民醫(yī)院中醫(yī)科 杭州 310014

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，發(fā)生率約20%～40%[1]，伴有終末期糖尿病腎病的5年生存率＜20%，是目前糖尿病患者致死致殘的主要原因，故早期治療，延緩其進(jìn)展，改善其預(yù)后至關(guān)重要。迄今為止，DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年來，一氧化氮（nitric oxide，NO）及一氧化氮合成酶（nitric oxide synthases，NOS）與DN的關(guān)系成為被關(guān)注的熱點(diǎn)問題。本研究通過觀察絞股藍(lán)顆粒對DN大鼠NO及NOS表達(dá)的影響，以探討其治療DN的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 健康SPF級(jí)SD大鼠48只，體重180～220g，雌雄各半，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)，合格證號(hào)：SCXK（滬）：2003－0003。

1.2 藥品與試劑 絞股藍(lán)顆粒（1g/包，相當(dāng)于生藥10g）由浙江省中醫(yī)院中藥制劑室提供；纈沙坦膠囊（商品名：代文，規(guī)格：80mg/粒，國藥準(zhǔn)字H20040217）由諾華制藥有限公司提供；鏈脲佐菌素（streptozin，STZ）由美國Sigma公司提供；RT－PCR反應(yīng)試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供；Trizol裂解液由美國GIBCOBRL公司提供；NO及NOS試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立與分組 隨機(jī)選取8只大鼠行左側(cè)腎摘除假手術(shù)操作，然后按5mL/kg尾靜脈注射pH4.4的檸檬酸緩沖液，作為正常對照組，其余40只大鼠按文獻(xiàn)[2]單側(cè)腎切除加STZ注射法改良復(fù)制DN模型。將DN模型大鼠隨機(jī)分為絞股藍(lán)顆粒低劑量組（0.15g/kg）、絞股藍(lán)顆粒中劑量組（0.3g/kg）、絞股藍(lán)顆粒高劑量組（0.6g/kg）、纈沙坦組（8mg/kg）和模型對照組，每組8只。絞股藍(lán)顆粒、纈沙坦粉均用生理鹽水配制成溶液，各組按上述劑量灌胃，大鼠每3天測量1次體質(zhì)量，根據(jù)各組大鼠的平均體質(zhì)量配制相應(yīng)濃度的溶液。大鼠灌胃給藥，1天1次，1次1.5mL，連續(xù)4周；正常和模型對照組灌胃等體積的生理鹽水。

2.2 標(biāo)本采集 各組大鼠分別于治療第4周末留取24h尿液，記尿量，用于測定尿肌酐和尿微量白蛋白；下腔靜脈抽取靜脈血，分裝用于檢測空腹血糖、血脂、血肌酐、尿素氮。處死后開腹取腎，用于測定NO含量、NOS活性及誘導(dǎo)型NOS（inducible nitric oxide synthase，iNOS）mRNA。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 血糖、血脂、血肌酐、尿素氮、尿肌酐、24h尿微量白蛋白 采用日本日立7170型全自動(dòng)生化儀測定，并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率。

2.3.2 腎臟肥大指數(shù) 腎臟肥大指數(shù)=腎重/體質(zhì)量×103。

2.3.3 腎組織NO含量 按試劑盒說明進(jìn)行操作。

2.3.4 腎組織NOS活性 按試劑盒說明進(jìn)行操作。

2.3.5 腎組織iNOS mRNA表達(dá) 由基因庫分別查得大鼠iNOSmRNA核苷酸序列，Primer Premier計(jì)算機(jī)軟件輔助引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，iNOS上游引物：5’－ATC CCG AAA CGC TAC ACTT－3’，下游引物：3’－TCT GGC GAA GAA CAA TCC－5’。取腎皮質(zhì) 100mg，Trizol法提取總RNA，取總RNA2μg，按逆轉(zhuǎn)錄操作說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及iNOS上下游引物各1μL加入PCR反應(yīng)液，按以下條件在PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng).：95℃預(yù)變性5min；然后按下述條件循環(huán)35 次：94℃ 40s、60℃ 40s、72℃ 90s，72℃ 10min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描。

3 結(jié) 果

3.1 一般情況 正常組大鼠體質(zhì)量增加明顯，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤，動(dòng)作自如，模型組大鼠具有典型“三多一少”的表現(xiàn)，且精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛豎無光澤，動(dòng)作遲緩，弓背蜷體；各治療組大鼠表現(xiàn)較模型組明顯減輕。

3.2 絞股藍(lán)顆粒對DN大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)及腎肥大指數(shù)的影響 結(jié)果見表1、2。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較（±s） mmol/L

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較（±s） mmol/L

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與纈沙坦組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別n/只血糖甘油三酯總膽固醇尿微量白蛋白/（mg/24h）絞股藍(lán)低劑量組 8 20.29±1.19▲▲*△△ 3.02±0.17▲▲** 2.35±0.13▲▲** 17.23±0.58▲▲*△絞股藍(lán)中劑量組 8 20.20±0.86▲▲*△△ 2.61±0.15▲▲*△△ 2.18±0.12▲▲**△ 16.90±0.47▲▲**絞股藍(lán)高劑量組 8 18.59±1.20▲▲*△△ 2.36±0.12▲**△△ 2.01±0.15▲▲**△△ 16.13±0.66▲▲**纈沙坦組 8 23.89±1.04▲▲ 3.22±0.19▲▲ 2.53±0.13▲▲ 16.28±0.73▲▲**模型組 8 24.31±1.82▲▲ 3.25±0.18▲▲ 2.61±0.16▲▲ 18.31±1.73▲▲正常組 8 6.13±0.78 2.16±0.17 1.25±0.11 6.13±1.08

表2 各組大鼠生化指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠生化指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與纈沙坦組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別n/只血肌酐/（μmol/L）尿素氮/（mmol/L）內(nèi)生肌酐清除率/（mL/min）腎臟肥大指數(shù)絞股藍(lán)低劑量組 8 72.74±9.54▲▲**△ 13.63±0.90▲▲*△ 2.37±0.11▲▲**△△ 6.56±0.56▲▲*△絞股藍(lán)中劑量組 8 70.84±10.21▲**△ 12.38±1.18▲▲** 2.16±0.10▲▲** 6.38±0.52▲▲**絞股藍(lán)高劑量組 8 68.84±12.15▲**△△ 11.25±0.99▲▲**△ 1.82±0.12▲▲**△△ 5.99±0.47▲▲**纈沙坦組 8 82.99±7.97▲▲ 12.48±1.19▲▲** 2.05±0.15▲▲** 5.99±0.34▲▲**模型組 8 86.95±6.59▲▲ 14.79±0.97▲▲ 2.56±0.17▲▲ 7.02±0.31▲▲正常組 8 59.49±7.76 6.59±1.03 1.00±0.09 3.47±0.28

3.3 絞股藍(lán)顆粒對DN大鼠NO含量、NOS活性及 iNOS mRNA表達(dá)的影響 見表3

表3 各組大鼠腎組織NO含量、NOS活性及iNOSmRNA表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織NO含量、NOS活性及iNOSmRNA表達(dá)量比較（±s）

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與纈沙坦組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 n/只 NO（μmol/g） tNOS（U/mg） iNOS（U/mg） iNOSmRNA/GAPDH絞股藍(lán)低劑量組 8 1.86±0.12▲▲*△△ 1.28±0.12▲▲△△ 0.48±0.04▲▲**△△ 0.75±0.08▲▲*△△絞股藍(lán)中劑量組 8 1.66±0.08▲▲**△ 1.16±0.10▲▲**△ 0.42±0.03▲▲**△ 0.64±0.07▲▲*△絞股藍(lán)高劑量組 8 1.52±0.12▲▲** 0.97±0.13▲▲** 0.35±0.06▲▲** 0.57±0.06▲▲**纈沙坦組 8 1.53±0.11▲▲** 1.01±0.09▲▲** 0.36±0.04▲▲** 0.56±0.05▲▲**模型組 8 1.97±0.12▲▲ 1.40±0.16▲▲ 0.61±0.07▲▲ 0.87±0.13▲▲正常組 8 0.71±0.09 0.53±0.09 0.18±0.03 0.44±0.07

圖1 各組大鼠腎組織iNOS mRNA表達(dá)

4 討論

DN病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為其發(fā)生和發(fā)展是由于糖代謝紊亂、脂代謝紊亂、高血壓、血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子分泌異常、反應(yīng)氧中間產(chǎn)物和遺傳因素等綜合作用的結(jié)果。高葡萄糖可通過各種機(jī)制[3]，如增加產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和晚期糖基化終產(chǎn)物，活化的ras基因和蛋白質(zhì)激酶C，以及刺激多元醇通路，誘發(fā)血管炎癥和改變基因表達(dá)的生長因子和細(xì)胞因子，從而發(fā)展成為DN。研究證明，DN患者脂代謝紊亂的程度明顯高于無腎病患者[4]。脂質(zhì)在腎臟沉積可引起腎小球基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)聚集，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管損傷，最終導(dǎo)致腎功能受損[5]。高脂血癥促進(jìn)DN的發(fā)生和發(fā)展，糖尿病則加重血脂紊亂，最終形成惡性循環(huán)，故控制血糖、血脂是防治DN的基礎(chǔ)措施。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，絞股藍(lán)顆粒能明顯降低實(shí)驗(yàn)DN大鼠血糖、甘油三酯、膽固醇（P＜0.05 或 P＜0.01），說明絞股藍(lán)顆粒具有改善DN糖脂代謝的作用，對防治糖脂毒性造成的嚴(yán)重腎臟損害有著重要意義。

NO是在NOS作用下，將L－精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)長－胍氨酸過程中的氧化產(chǎn)物，由于NO的代謝速度很快，半衰期極短，體內(nèi)NO合成的主要限速因素是NOS。NOS有三種亞型，分別為神經(jīng)型NOS、內(nèi)皮型NOS、i－NOS。前兩者為細(xì)胞所固有，又稱為結(jié)構(gòu)型NOS（cNOS），依靠Ca2+/鈣調(diào)蛋白激活，在生理狀態(tài)下可按機(jī)體的需要，產(chǎn)生短暫性、少量的NO脈沖釋放，功能主要為細(xì)胞間信號(hào)傳遞；而iNOS的活性不依賴于Ca2+/鈣調(diào)蛋白，而需要誘導(dǎo)因子如內(nèi)毒素、干擾素、白介素等存在，在病理狀態(tài)下才表達(dá)，且不受限制，催化作用時(shí)間長，產(chǎn)生的大量NO，參與病理生理過程，造成組織細(xì)胞損傷，并引起血流動(dòng)力學(xué)改變[6]。研究表明，糖尿病狀態(tài)下，多種因素可使iNOS被誘導(dǎo)而表達(dá)增加[7]，誘導(dǎo)后iNOS活性較cNOS合成的NO濃度高1000倍[8]，是引起體內(nèi)NO過量產(chǎn)生的主要基礎(chǔ)。NO是一種具有強(qiáng)烈擴(kuò)血管作用的物質(zhì)，由于其對腎臟入球小動(dòng)脈舒張作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于出球小動(dòng)脈，因此，腎臟局部大量生成的NO可使腎小球內(nèi)壓升高，腎小球高濾過、高灌注形成。而糖尿病早期腎小球的高濾過和高灌注是DN發(fā)生的始動(dòng)因素，久之便導(dǎo)致系膜細(xì)胞肥大與基質(zhì)的增生，最后發(fā)生腎小球硬化。此外，NO還通過形成過氧化亞硝基陰離子（ONOO－）和氫氧根自由基誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致組織損傷。高水平的NO還可損傷線粒體、含鐵硫蛋白酶和DNA，直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

中醫(yī)認(rèn)為，DN為脾腎虛損、濁毒潴留、腎絡(luò)瘀滯所致，乃“本虛標(biāo)實(shí)”之證。絞股藍(lán)味苦，微甘，性寒，入脾、肺、腎經(jīng)，功善益氣健脾，滋陰益腎，養(yǎng)心安神，消痰化瘀，與DN的病機(jī)特點(diǎn)吻合。其作為五加科以外的唯一含有人參皂苷相似結(jié)構(gòu)有效成分的植物，化學(xué)成分主要為絞股藍(lán)皂苷、黃酮類、多糖類，還有脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素、維生素等多種成分，藥理活性廣泛。Ke Norberg等[10]發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)除了能夠降低血脂、血糖、提高免疫功能外，還能夠促進(jìn)胰島素釋放。絞股藍(lán)顆粒是在絞股藍(lán)飲片的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新劑型，具有功效成分含量高，服用量少，服用、攜帶方便，可與其他中藥顆粒配伍靈活應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。絞股藍(lán)具有腎臟保護(hù)作用，孫萬森等[11]研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)皂苷能降低慢性腎功能衰竭患者的血脂，升高血紅蛋白，改善腎功能及保護(hù)腎臟。黃萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)可直接干預(yù)DN的多個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)，具有降血脂、降低尿微量白蛋白排泄率等作用，對DN有明確的腎保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常大鼠比較，DN大鼠腎組織中NO含量明顯增高及tNOS、iNOS活性明顯上升，iNOS mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。而絞股藍(lán)顆粒能有效降低DN大鼠腎組織NO含量及tNOS、iNOS活性，并下調(diào)DN大鼠iNOS mRNA表達(dá)。考慮絞股藍(lán)顆粒對DN大鼠的部分腎臟保護(hù)作用，可能是介導(dǎo)調(diào)節(jié)NO含量、NOS活性及iNOS mRNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。至于絞股藍(lán)顆粒是否對cNOS的表達(dá)起作用，以及是否還通過其他途徑來實(shí)現(xiàn)其對早期DN的腎臟保護(hù)作用，都有待進(jìn)一步深入研究。

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