嚴(yán)曉玲 鄒剛 段濤＊

（1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200032；2.上海市第一婦嬰保健院，上海 200040）

人類的遺傳圖譜繪制需要應(yīng)用多態(tài)性標(biāo)志。首先出現(xiàn)的多態(tài)性標(biāo)志是20世紀(jì)80年代中期最早應(yīng)用的限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）。此類標(biāo)記數(shù)量較少，多態(tài)性信息含量也較低。80年代后發(fā)展了短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR），又稱微衛(wèi)星（microsatellite，MS），其染色體分布和信息含量明顯優(yōu)于RFLP。近年又有第三代多態(tài)性標(biāo)志SNP被大量發(fā)現(xiàn)，成為研究基因組多樣性和識(shí)別、定義疾病相關(guān)基因的一種手段。

STR具有高度多態(tài)性、雜合度和多態(tài)信息量，主要源于核心序列重復(fù)次數(shù)個(gè)體間的差異，這種差異在基因傳遞過程中一般遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律，均勻地分布于人類基因組。本研究在50例無(wú)關(guān)個(gè)體中檢測(cè)13、18、21號(hào)三條染色體上18個(gè)str位點(diǎn)的多態(tài)性和雜合度，并在5例21-三體綜合征患者的外周血中進(jìn)行檢測(cè)，用以了解是否可在染色體數(shù)目異常的檢測(cè)中被使用。

1 材料和方法

1.1 對(duì)象來源 從2008～2009年在本院就診的患者，抽取50例正常人抗凝全血樣本和5例21-三體綜合征患者的外周血抗凝全血標(biāo)本。

1.2 試劑和設(shè)備

1.2.1 試劑 QIAamp DNA Blood Mini Kit購(gòu)自瑞士Qiagen公司；熒光素（FAM、HEX、TAMRA）和金牌Taq酶購(gòu)自美國(guó)ABI公司；引物合成與熒光素標(biāo)記由上海生工生物技術(shù)有限公司完成；PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、Mg2+購(gòu)自瑞士Qiagen公司。

1.2.2 設(shè)備 美國(guó)ABI公司2700型擴(kuò)增儀、3130型遺傳分析，德國(guó)EPPENDORF公司的微量移液器、高速離心機(jī)、ELGA公司純水儀、德國(guó)Heraeus Biofuge Pico離心機(jī)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和合成 在STR基因座的選擇上，選擇基因座首先符合Hardy-Weinberg平衡，多態(tài)信息含量大于0.5，雜合度在0.6以上的基因座［1］。串聯(lián)重復(fù)單位為四或五核苷酸，確定的基因座見下表1。UCSC（http：／／genome.ucsc.edu／）上搜基因原序列。在引物設(shè)計(jì)過程中主要考慮以下影響因素：①引物長(zhǎng)度在19～28bp之間；②各基因引物Tm值盡量一致；③PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在400次／分以內(nèi)。使用primer premier 5.0設(shè)計(jì)PCR引物。

表1 各STR位點(diǎn)及其引物信息

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為5μL：早先加入板中的10ng DNA模板（即2.5μL模板），0.25μM引物（正反引物各0.05μL），25units DNA聚合酶 （0.05μL），2mM MgCl2（0.3μL）及200μM dNTP（0.3μL）。熱循環(huán)條件選用退火溫度逐漸降低的程序（touchdown），如圖1：

①94℃變性5分鐘；

②94℃變性30秒；

③64℃退火30秒；

④72℃延伸60秒；

⑤ 返回②44個(gè)循環(huán)，退火溫度依次下降0.5℃至57℃后維持；

⑥72℃延伸10分鐘。

1.3.2 熒光素的選擇 由于不同的熒光素在光譜上存在一定的干擾，熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)越接近，干擾會(huì)越強(qiáng)烈，不同的熒光素標(biāo)記方式會(huì)產(chǎn)生不同的分子構(gòu)象，從而影響分子的電泳遷移率和激光對(duì)熒光素的激發(fā)［2］。同時(shí)參考 Micel B等的文獻(xiàn)報(bào)道，選擇FAM、HEX、TAMRA進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 毛細(xì)管電泳和測(cè)序 使用ABI3130基因測(cè)序儀，使用3130數(shù)據(jù)收集軟件的樣品列表，對(duì)樣本設(shè)置不同名字和編碼，確定內(nèi)標(biāo)，按顏色信息和解釋將數(shù)據(jù)納入表格中，建立熒光標(biāo)記，用36cm毛細(xì)管運(yùn)行模式處理樣本，關(guān)鍵參數(shù)是聚合物和毛細(xì)管列陣的設(shè)置。經(jīng)Gene Mapper ID 3.2軟件分析處理。

其具體步驟為：

① 加入6.85μL GS500LIZ內(nèi)標(biāo)，與250μL Hi-Di甲酰胺混勻后，并取出15μL加入相應(yīng)的96孔板中；

② 加入3μL待測(cè)PCR產(chǎn)物，混勻，密封96孔板；

③將96孔板置于PCR儀上94℃保持3分鐘，降溫到4℃保持30秒；

④1 000轉(zhuǎn)離心10秒后放入測(cè)序儀中。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS12.0軟件使用直接計(jì)算法，計(jì)算每個(gè)等位基因出現(xiàn)的頻數(shù)與頻率以及每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)各雜合子峰面積比值的平均值和其標(biāo)準(zhǔn)差。

峰面積的計(jì)算公式根據(jù)色譜峰面積A的測(cè)量方法：

峰面積A=1.065h×w1／2（h為熒光峰的高度，w為峰寬）

雜合度的計(jì)算公式［3］：

H=N［1-∑pi2］／（N-1）（pi為第i個(gè)等位基因的頻率，N為樣本數(shù)）

PIC［4］的計(jì)算公式：

PIC=1-∑Pi2-∑∑2Pi2Pj2

i=1 i=1j=i+1

Pi、Pj分別為第i、j個(gè)等位基因的頻率。

圖1 熱循環(huán)條件選用退火溫度逐漸降低的程序（touchdown）

2 結(jié)果

2.1 50例正常無(wú)關(guān)二倍體中，根據(jù)染色體的不同，STR位點(diǎn)的雜合度和多態(tài)信息含量（見表2）。21號(hào)染色體選取11個(gè)STR位點(diǎn)（D21S11L、D21S1409、 D21S1809、 D21S2052、 D21S1994、D21S1446、 D21S1435、 D21S11D21S1442、D21S1809、D21S1432），其中D21S11的雜合度和多態(tài)信息含量最高，遺傳多態(tài)性較佳。D21S1809遺傳多態(tài)性較差。13號(hào)染色體選取3個(gè)STR位點(diǎn)（D13S800、D13S886、D13S796），其中D13S886遺傳多態(tài)性較好、D13S800遺傳多態(tài)性較差。18號(hào)染色體 選 取 4 個(gè) STR 位 點(diǎn) （D18S877、D18S851、D18S847、D18S847），其中D18S819遺傳多態(tài)性較好、D18S851遺傳多態(tài)性較差。

2.2 50例無(wú)關(guān)人群的外周血經(jīng)過染色體核型分析證實(shí)為正常二倍體，通過對(duì)13、18、21染色體STR位點(diǎn)的檢測(cè)，二倍體檢出率為100%。

2.3 5例21-三體綜合征患者的外周血抗凝血標(biāo)本，檢出率為100%。5例樣本都呈現(xiàn)雙峰面積比例1：2或2：1或1：1：1。圖2為1例21-三體綜合征患者的STR位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物圖：

3 討論

表2 STR位點(diǎn)的雜合度和多態(tài)信息含量

基因組掃描是目前定位疾病基因最常用的方法，在進(jìn)行基因組掃描時(shí)，由于所選擇的多態(tài)位點(diǎn)間距較大，為獲得足夠信息采用多態(tài)信息量高，分型容易的多態(tài)位點(diǎn)是連鎖分析成功的關(guān)鍵，而STR的高度多態(tài)性和高頻性的特點(diǎn)，使STR成為目前應(yīng)用最廣的人類遺傳標(biāo)志。STR絕大多數(shù)位于非編碼區(qū)，不轉(zhuǎn)錄、不編碼蛋白質(zhì)和RNA，不受選擇壓力的影響，其2條帶的擴(kuò)增產(chǎn)量相等，不存在優(yōu)先擴(kuò)增和漏帶現(xiàn)象。雜合度（heterozygosity）是指隨機(jī)選擇的某個(gè)個(gè)體在某一標(biāo)記位點(diǎn)上同時(shí)具有2個(gè)不同的等位基因的可能性。PIC（polymorphism information content）是多態(tài)信息含量，是衡量DNA位點(diǎn)信息度（即利用該位點(diǎn)去對(duì)興趣基因或者另一位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析時(shí)可以獲得的信息量，從而判斷該位點(diǎn)與其他基因或位點(diǎn)之間的連鎖關(guān)系）的一個(gè)參數(shù)。PIC主要源于核心序列重復(fù)次數(shù)個(gè)體間的差異，這種差異在基因傳遞過程中一般遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律，均勻地分布于人類基因組［5］。

STR遺傳多態(tài)性可用雜合度和多態(tài)信息量等指標(biāo)來衡量，多態(tài)信息量大于0.5，表明遺傳標(biāo)記可提供高度的遺傳信息［6］。多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率、雜合度、多態(tài)信息含量等參數(shù)因樣本來源、群體不同而有差異，本研究分析的18個(gè)位點(diǎn)均選自在白種人群中多態(tài)性較好的多態(tài)位點(diǎn)［7］。通過對(duì)50例正常無(wú)關(guān)亞洲人群外周血來檢測(cè)STR的實(shí)際雜合度、多態(tài)信息量的檢測(cè)，新位點(diǎn)的多態(tài)遺傳信息含量為0.62～0.87，均＞0.5，表明本實(shí)驗(yàn)所選取的微衛(wèi)星標(biāo)記基本上可提供高度的遺傳信息。結(jié)果顯示實(shí)際的雜合度與文獻(xiàn)和基因庫(kù)中所記載的雜合度相似，但實(shí)際檢測(cè)值較低可能與樣本量較小有關(guān)。另外我們的預(yù)計(jì)值多來自西方文獻(xiàn)報(bào)道，可能與我們漢族人群特別是上海地區(qū)人群存在一定差異。

在實(shí)際操作中會(huì)出現(xiàn)同一座位的等位基因會(huì)由于優(yōu)先擴(kuò)增而導(dǎo)致等位基因脫失（ADO），即在PCR反應(yīng)起始時(shí)，一個(gè)正常的二倍體細(xì)胞的2個(gè)等位基因中的一個(gè)會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，并隨著反應(yīng)地進(jìn)行被優(yōu)先擴(kuò)增的產(chǎn)物也被用作模板過渡表達(dá)［8］，所以在結(jié)果中顯示的等位基因的峰面積比值并不是完全的1：1，比值范圍在0.9～1.28之間，與文獻(xiàn)報(bào)道［9］的正常雜合二倍體每一檢測(cè)位點(diǎn)雙峰面積比值一般在0.8到1.4的范圍內(nèi)相符合。

高雅等曾以中國(guó)30個(gè)不同民族的9個(gè)常染色體STR基因座的群體遺傳研究數(shù)據(jù)資料為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在一定范圍之內(nèi)，樣本量的大小與所觀測(cè)到的不同基因座等位基因檢出數(shù)量之間存在正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)超過一定范圍時(shí)，樣本量的繼續(xù)增加不再明顯影響等位基因的檢出數(shù)量。多態(tài)性低的基因座需要的樣本量較小，50個(gè)樣本量即可以檢測(cè)出常見等位基因。

在使用單管多重QF-PCR體系中，我們使用新位點(diǎn)對(duì)5例21-三體綜合征患者外周血進(jìn)行檢測(cè)，沒用假陽(yáng)性和假陰性，通過11個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合檢測(cè)，檢出率高達(dá)100%。杜鵑［10］等曾采用5個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)21-三體，證實(shí)使用4個(gè)以上位點(diǎn)結(jié)合檢出21-三體才可達(dá)100%。因此，上述新位點(diǎn)可被用于21-三體的診斷。

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