蓬桂華，詹永發(fā)，蘇丹，何建文

（貴州省辣椒研究所，貴州遵義，563006）

辣椒以其特有的色澤、辣味、香味和豐富的維生素C而成為一種世界性的蔬菜作物，它既可鮮食、調(diào)味，也可入藥，是提煉辣椒油、辣椒紅素和辣椒素的原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食療保健作用[1]。

近年來(lái)，辣椒分子領(lǐng)域的研究逐步成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，而提取高質(zhì)量的DNA分子是分子研究的基礎(chǔ)。目前，常用的的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基溴化銨 （CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法和高鹽低pH法[2]。其中，SDS法操作簡(jiǎn)單、溫和，并可提取到較高分子量DNA，但所得產(chǎn)物含糖類(lèi)雜質(zhì)較多，這將直接影響DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果；CTAB可破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，并能與核酸形成復(fù)合物，再加入乙醇后可使核酸沉淀，而CTAB則溶于乙醇，進(jìn)而從富含多酚和多糖的植物組織中分離出高質(zhì)量基因組DNA[3]；高鹽低pH法可有效地防止組織破碎和沉淀大量材料時(shí)的電離化作用及酚類(lèi)化合物的進(jìn)一步氧化[4]，但高鹽低pH法提取DNA產(chǎn)率較低，且殘留的較多小分子鹽也會(huì)影響分子生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果[2]。由于不同材料所含的物質(zhì)成分及各種成分的含量差異較大，而這種差異隨植物種類(lèi)、植物組織或植物組織的發(fā)育階段等的不同而變化，因此，對(duì)于不同植物DNA提取應(yīng)采取不同的方法[5]。

本研究采用改良CTAB法和SDS法分別提取辣椒基因組DNA，并對(duì)這2種方法進(jìn)行比較分析，旨在篩選出一種快速、簡(jiǎn)便且可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法，為進(jìn)一步開(kāi)展辣椒分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為辣椒種子A和B，均由貴州省辣椒研究所提供。將2層濾紙放入培養(yǎng)皿構(gòu)成發(fā)芽苗床進(jìn)行辣椒種子發(fā)芽，期間用Hoagland's營(yíng)養(yǎng)液澆灌，待幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí)，取幼嫩植株。

供試儀器有高速冷凍離心機(jī)（Benkman），恒溫水槽，水平電泳儀 （DYY-7C），核酸蛋白分析儀（Gene Quit 1300），全自動(dòng)凝膠系統(tǒng)。

供試試劑有 EDTA、NaCl、CTAB、巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、SDS、β-巰基乙醇、醋酸鉀、瓊脂糖。

1.2 試驗(yàn)方法

①改良的CTAB法 按照提取植物DNA的經(jīng)典方法加以改良來(lái)提取辣椒DNA：取0.1 g新鮮辣椒幼嫩植株，置于研缽中，加入700 μL 2%的CTAB提取液磨樣，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中；65℃水浴30 min（期間取出振蕩2次）；取出冷卻至室溫，加等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），搖床上（130～140 r/min）搖至乳白色；4 000 r/min離心10 min；取出上清液至另一支1.5 mL離心管，加入0.8倍體積的異丙醇（-20℃下預(yù)冷）沉淀 DNA，靜置或輕搖；8 000 r/min離心 2 min，棄掉上清液；加1 mL 70%乙醇（-20℃下預(yù)冷）洗滌；8 000 r/min離心2 min，倒掉乙醇，自然干燥至無(wú)乙醇味；加200 μL超純水4℃下溶解；-20℃保存。

②SDS法 取0.1 g新鮮辣椒幼嫩植株，置于研缽中，加入700 μL的SDS提取液磨樣，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中；65℃水浴30 min（期間取出振蕩2次）；取出冷卻至室溫，加入250 μL醋酸鉀冰上震蕩20 min，4 000 r/min離心10 min；取出上清液至另一支1.5 mL離心管，加入0.8倍體積的異丙醇（-20℃下預(yù)冷）沉淀 DNA，靜置或輕搖；8 000 r/min離心2 min，棄掉上清液；加1 mL 70%乙醇（-20℃下預(yù)冷）洗滌；8 000 r/min離心2 min，倒掉乙醇，自然干燥至無(wú)乙醇味；加200 μL超純水4℃下溶解；-20℃保存。

③基因組DNA樣品的濃度檢測(cè) 利用核酸蛋白分析儀檢測(cè)所提取DNA樣品的濃度和質(zhì)量，并根據(jù)A260/A280值判斷DNA樣品的純度。純DNA樣品的 A260/A280值應(yīng)為 1.8～1.9，A260/A230值應(yīng)大于2.0。A260/A280值大于1.9時(shí)，表明有RNA污染；小于1.6時(shí)，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚類(lèi)物質(zhì)污染。A260/A230值小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存鹽和小分子雜質(zhì)，如核甘酸、氨基酸、酚等[6]。

④基因組DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 用1%的瓊脂糖凝膠電泳及godview染色，檢測(cè)提取基因組DNA質(zhì)量，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法的結(jié)果比較

由表1可以看出，CTAB法提取的辣椒基因組DNA A260/A280的比值為1.87～1.88，大于1.6，小于1.9，說(shuō)明所提取DNA樣品中沒(méi)有蛋白質(zhì)污染；SDS法提取的A260/A280的比值大于1.9，說(shuō)明提取DNA樣品中含有RNA，DNA純度不高。CTAB法和SDS法的A260/A230值均大于2.0，說(shuō)明2種方法都能較好地去除酚類(lèi)物質(zhì)及小分子鹽。另外，從DNA的濃度上看出，SDS法的產(chǎn)率最高，是CTAB法的2倍多。通過(guò)兩個(gè)品種的比較，2種方法在2個(gè)品種上的差異較小，表明2種方法對(duì)辣椒品種選擇沒(méi)有特殊要求，能用于不同辣椒品種的DNA提取。

表1 辣椒基因組DNA提取方法檢測(cè)結(jié)果

2.2 兩種方法提取辣椒基因組DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1所示，對(duì)2種方法提取的辣椒幼苗的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，2種方法提取的DNA均有一條單一的信號(hào)強(qiáng)的主帶，點(diǎn)樣孔無(wú)亮點(diǎn)，說(shuō)明沒(méi)有多糖等雜質(zhì)的污染。CTAB法（1～3道和7～9道）提取的DNA條帶均勻一致，拖尾彌散現(xiàn)象很少，說(shuō)明DNA純度較高，無(wú)RNA污染；SDS 法（4～6 道、10～12 道）提取的 DNA 條帶出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾彌散等現(xiàn)象，說(shuō)明DNA發(fā)生部分降解，但SDS法的條帶較CTAB法的條帶大，說(shuō)明SDS法的產(chǎn)率較CTAB法的高。另外，2種方法在不同的品種上表現(xiàn)較為一致，說(shuō)明這2種方法都適用于不同品種辣椒DNA的提取。

圖1 辣椒基因組DNA提取凝膠電泳檢測(cè)

3 小結(jié)與討論

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，快速、經(jīng)濟(jì)、安全、高效地提取辣椒基因組DNA為其在資源鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系評(píng)估、分子標(biāo)記輔助選擇等方面奠定基礎(chǔ)。辣椒葉片中富含的酚類(lèi)物質(zhì)不僅可導(dǎo)致DNA降解，與DNA結(jié)合形成黃色至黑褐色的難以溶解的沉淀物，還可使提取液顏色變深，因此很難得到高純度DNA。本研究通過(guò)應(yīng)用改良的CTAB法提取的辣椒基因組DNA，經(jīng)分析其A260/A280的比值為1.87～1.88，樣品DNA的純度較高，不含蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)。而應(yīng)用SDS法提取的辣椒基因組DNA A260/A280的比值大于1.9，提取的DNA純度不高，并出現(xiàn)DNA降解現(xiàn)象，但SDS法提取的辣椒基因組DNA的產(chǎn)率比CTAB法的高。與石慶華等[8]通過(guò)對(duì)刺山柑的研究指出，CTAB法提取DNA的A260/A280的比值大于1.8，而SDS法的為1.65左右，李娟玲等[9]通過(guò)改良CTAB法提取鷓鴣茶基因組DNA的A260/A280的比值在1.8左右的研究結(jié)果相一致。另外，還有研究認(rèn)為，CTAB法在香蕉[10]、大花萱草[11]、蘋(píng)果[12]上提取DNA的純度高于SDS法。

本研究結(jié)果表明，通過(guò)改良的CTAB法和SDS法都能提取出辣椒的總DNA。改良CTAB法提取的辣椒基因組DNA質(zhì)量高于SDS，但SDS法提取的量大于CTAB法，研究者可以根據(jù)自己的試驗(yàn)要求合理選擇適合的提取方法。

[1]程永安.辣椒無(wú)公害生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：3-4.

[2]丁芳林，彭書(shū)練.黃芩高質(zhì)量DNA提取方法研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（7）：23-25.

[3]羅志勇，周鋼，陳湘暉，等.高質(zhì)量植物基因組DNA的分離[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，26（2）：178-180.

[4]張娟，張道遠(yuǎn)，尹林克.剛毛檉柳基因組DNA提取和RAPD反應(yīng)條件探索[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（2）：253-256.

[5]袁長(zhǎng)春，施蘇華，葉創(chuàng)興.從富含酚類(lèi)的茶類(lèi)植物葉中提取純凈的總 DNA[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)論叢，2001，21（3）：1-4.

[6]沈潔，羅安才.提取蕨類(lèi)植物DNA方法比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：1 738-1 740.

[7]俞文政，楊貴，張映南，等.辣椒基因組DNA提取方法研究[J].辣椒雜志，2007（4）：39-43.

[8]石慶華，代培紅，許磊，等.刺山柑（Capparis spinosaL.）基因組DNA提取方法的比較 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（8）：1 512-1 516.

[9]李娟玲，劉國(guó)民，賈媛，等.一種高效提取鷓鴣茶基因組DNA 的方法[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（8）：69-73.

[10]易干軍，于曉英，霍合強(qiáng)，等.香蕉種質(zhì)資源的AFLP鑒別與分類(lèi)中 DNA 模板的制備[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2001，18（6）：345-348.

[11]于曉英，吳鐵明，彭盡暉，等.萱草種質(zhì)資源擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性鑒別與分類(lèi)的研究I.萱草DNA模板的制備[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，27（1）：41-43.

[12]王彩虹，王倩，戴洪義，等.蘋(píng)果基因組AFLP分析的DNA模板的制備及技術(shù)體系的建立[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，32（2）：197-200.