蓬桂華，詹永發(fā)，蘇丹，何建文

（貴州省辣椒研究所，貴州遵義，563006）

辣椒以其特有的色澤、辣味、香味和豐富的維生素C而成為一種世界性的蔬菜作物，它既可鮮食、調(diào)味，也可入藥，是提煉辣椒油、辣椒紅素和辣椒素的原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和食療保健作用[1]。

近年來，辣椒分子領(lǐng)域的研究逐步成為國內(nèi)外研究的熱點，而提取高質(zhì)量的DNA分子是分子研究的基礎(chǔ)。目前，常用的的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基溴化銨 （CTAB）法、十二烷基硫酸鈉（SDS）法和高鹽低pH法[2]。其中，SDS法操作簡單、溫和，并可提取到較高分子量DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多，這將直接影響DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果；CTAB可破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，并能與核酸形成復(fù)合物，再加入乙醇后可使核酸沉淀，而CTAB則溶于乙醇，進(jìn)而從富含多酚和多糖的植物組織中分離出高質(zhì)量基因組DNA[3]；高鹽低pH法可有效地防止組織破碎和沉淀大量材料時的電離化作用及酚類化合物的進(jìn)一步氧化[4]，但高鹽低pH法提取DNA產(chǎn)率較低，且殘留的較多小分子鹽也會影響分子生物學(xué)試驗結(jié)果[2]。由于不同材料所含的物質(zhì)成分及各種成分的含量差異較大，而這種差異隨植物種類、植物組織或植物組織的發(fā)育階段等的不同而變化，因此，對于不同植物DNA提取應(yīng)采取不同的方法[5]。

本研究采用改良CTAB法和SDS法分別提取辣椒基因組DNA，并對這2種方法進(jìn)行比較分析，旨在篩選出一種快速、簡便且可獲得高質(zhì)量DNA分子的提取方法，為進(jìn)一步開展辣椒分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為辣椒種子A和B，均由貴州省辣椒研究所提供。將2層濾紙放入培養(yǎng)皿構(gòu)成發(fā)芽苗床進(jìn)行辣椒種子發(fā)芽，期間用Hoagland's營養(yǎng)液澆灌，待幼苗長出2～3片真葉時，取幼嫩植株。

供試儀器有高速冷凍離心機(jī)（Benkman），恒溫水槽，水平電泳儀 （DYY-7C），核酸蛋白分析儀（Gene Quit 1300），全自動凝膠系統(tǒng)。

供試試劑有 EDTA、NaCl、CTAB、巰基乙醇、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、SDS、β-巰基乙醇、醋酸鉀、瓊脂糖。

1.2 試驗方法

①改良的CTAB法 按照提取植物DNA的經(jīng)典方法加以改良來提取辣椒DNA：取0.1 g新鮮辣椒幼嫩植株，置于研缽中，加入700 μL 2%的CTAB提取液磨樣，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中；65℃水浴30 min（期間取出振蕩2次）；取出冷卻至室溫，加等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），搖床上（130～140 r/min）搖至乳白色；4 000 r/min離心10 min；取出上清液至另一支1.5 mL離心管，加入0.8倍體積的異丙醇（-20℃下預(yù)冷）沉淀 DNA，靜置或輕搖；8 000 r/min離心 2 min，棄掉上清液；加1 mL 70%乙醇（-20℃下預(yù)冷）洗滌；8 000 r/min離心2 min，倒掉乙醇，自然干燥至無乙醇味；加200 μL超純水4℃下溶解；-20℃保存。

②SDS法 取0.1 g新鮮辣椒幼嫩植株，置于研缽中，加入700 μL的SDS提取液磨樣，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中；65℃水浴30 min（期間取出振蕩2次）；取出冷卻至室溫，加入250 μL醋酸鉀冰上震蕩20 min，4 000 r/min離心10 min；取出上清液至另一支1.5 mL離心管，加入0.8倍體積的異丙醇（-20℃下預(yù)冷）沉淀 DNA，靜置或輕搖；8 000 r/min離心2 min，棄掉上清液；加1 mL 70%乙醇（-20℃下預(yù)冷）洗滌；8 000 r/min離心2 min，倒掉乙醇，自然干燥至無乙醇味；加200 μL超純水4℃下溶解；-20℃保存。

③基因組DNA樣品的濃度檢測 利用核酸蛋白分析儀檢測所提取DNA樣品的濃度和質(zhì)量，并根據(jù)A260/A280值判斷DNA樣品的純度。純DNA樣品的 A260/A280值應(yīng)為 1.8～1.9，A260/A230值應(yīng)大于2.0。A260/A280值大于1.9時，表明有RNA污染；小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染。A260/A230值小于2.0時，表明溶液中有殘存鹽和小分子雜質(zhì)，如核甘酸、氨基酸、酚等[6]。

④基因組DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測 用1%的瓊脂糖凝膠電泳及godview染色，檢測提取基因組DNA質(zhì)量，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法的結(jié)果比較

由表1可以看出，CTAB法提取的辣椒基因組DNA A260/A280的比值為1.87～1.88，大于1.6，小于1.9，說明所提取DNA樣品中沒有蛋白質(zhì)污染；SDS法提取的A260/A280的比值大于1.9，說明提取DNA樣品中含有RNA，DNA純度不高。CTAB法和SDS法的A260/A230值均大于2.0，說明2種方法都能較好地去除酚類物質(zhì)及小分子鹽。另外，從DNA的濃度上看出，SDS法的產(chǎn)率最高，是CTAB法的2倍多。通過兩個品種的比較，2種方法在2個品種上的差異較小，表明2種方法對辣椒品種選擇沒有特殊要求，能用于不同辣椒品種的DNA提取。

表1 辣椒基因組DNA提取方法檢測結(jié)果

2.2 兩種方法提取辣椒基因組DNA的電泳檢測結(jié)果

圖1所示，對2種方法提取的辣椒幼苗的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，2種方法提取的DNA均有一條單一的信號強(qiáng)的主帶，點樣孔無亮點，說明沒有多糖等雜質(zhì)的污染。CTAB法（1～3道和7～9道）提取的DNA條帶均勻一致，拖尾彌散現(xiàn)象很少，說明DNA純度較高，無RNA污染；SDS 法（4～6 道、10～12 道）提取的 DNA 條帶出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾彌散等現(xiàn)象，說明DNA發(fā)生部分降解，但SDS法的條帶較CTAB法的條帶大，說明SDS法的產(chǎn)率較CTAB法的高。另外，2種方法在不同的品種上表現(xiàn)較為一致，說明這2種方法都適用于不同品種辣椒DNA的提取。

圖1 辣椒基因組DNA提取凝膠電泳檢測

3 小結(jié)與討論

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，快速、經(jīng)濟(jì)、安全、高效地提取辣椒基因組DNA為其在資源鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系評估、分子標(biāo)記輔助選擇等方面奠定基礎(chǔ)。辣椒葉片中富含的酚類物質(zhì)不僅可導(dǎo)致DNA降解，與DNA結(jié)合形成黃色至黑褐色的難以溶解的沉淀物，還可使提取液顏色變深，因此很難得到高純度DNA。本研究通過應(yīng)用改良的CTAB法提取的辣椒基因組DNA，經(jīng)分析其A260/A280的比值為1.87～1.88，樣品DNA的純度較高，不含蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)。而應(yīng)用SDS法提取的辣椒基因組DNA A260/A280的比值大于1.9，提取的DNA純度不高，并出現(xiàn)DNA降解現(xiàn)象，但SDS法提取的辣椒基因組DNA的產(chǎn)率比CTAB法的高。與石慶華等[8]通過對刺山柑的研究指出，CTAB法提取DNA的A260/A280的比值大于1.8，而SDS法的為1.65左右，李娟玲等[9]通過改良CTAB法提取鷓鴣茶基因組DNA的A260/A280的比值在1.8左右的研究結(jié)果相一致。另外，還有研究認(rèn)為，CTAB法在香蕉[10]、大花萱草[11]、蘋果[12]上提取DNA的純度高于SDS法。

本研究結(jié)果表明，通過改良的CTAB法和SDS法都能提取出辣椒的總DNA。改良CTAB法提取的辣椒基因組DNA質(zhì)量高于SDS，但SDS法提取的量大于CTAB法，研究者可以根據(jù)自己的試驗要求合理選擇適合的提取方法。

[1]程永安.辣椒無公害生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：3-4.

[2]丁芳林，彭書練.黃芩高質(zhì)量DNA提取方法研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（7）：23-25.

[3]羅志勇，周鋼，陳湘暉，等.高質(zhì)量植物基因組DNA的分離[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，26（2）：178-180.

[4]張娟，張道遠(yuǎn)，尹林克.剛毛檉柳基因組DNA提取和RAPD反應(yīng)條件探索[J].西北植物學(xué)報，2003，23（2）：253-256.

[5]袁長春，施蘇華，葉創(chuàng)興.從富含酚類的茶類植物葉中提取純凈的總 DNA[J].中山大學(xué)學(xué)報論叢，2001，21（3）：1-4.

[6]沈潔，羅安才.提取蕨類植物DNA方法比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（4）：1 738-1 740.

[7]俞文政，楊貴，張映南，等.辣椒基因組DNA提取方法研究[J].辣椒雜志，2007（4）：39-43.

[8]石慶華，代培紅，許磊，等.刺山柑（Capparis spinosaL.）基因組DNA提取方法的比較 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（8）：1 512-1 516.

[9]李娟玲，劉國民，賈媛，等.一種高效提取鷓鴣茶基因組DNA 的方法[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（8）：69-73.

[10]易干軍，于曉英，霍合強(qiáng)，等.香蕉種質(zhì)資源的AFLP鑒別與分類中 DNA 模板的制備[J].果樹學(xué)報，2001，18（6）：345-348.

[11]于曉英，吳鐵明，彭盡暉，等.萱草種質(zhì)資源擴(kuò)增片段長度多態(tài)性鑒別與分類的研究I.萱草DNA模板的制備[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2001，27（1）：41-43.

[12]王彩虹，王倩，戴洪義，等.蘋果基因組AFLP分析的DNA模板的制備及技術(shù)體系的建立[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2001，32（2）：197-200.