黃獻平，鄭景輝，袁肇凱*，李勇華，王麗萍，簡維雄，孫貴香

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)國家重點學(xué)科，國家中醫(yī)藥管理局病理生理實驗室，湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208）

心肌缺血性疾病一直是臨床治療的難點。心肌缺血引起心肌細胞壞死、凋亡，造成心肌數(shù)目減少，心室重構(gòu)促使心力衰竭發(fā)生。通常認為心肌細胞是終末分化細胞，缺乏增殖分化能力，損傷后不能再生。近年來研究表明，通過MSCs移植改善缺血心肌功能，重建梗死心肌喪失的心肌細胞以治療缺血性心臟病，顯示有良好的臨床應(yīng)用前景，已成為國內(nèi)外心血管病研究領(lǐng)域的熱點［1－3］。 GATA－4 基因是心臟前體細胞的最早期標(biāo)志之一，調(diào)節(jié)心肌細胞的發(fā)生、分化及心臟前體細胞形成線狀肌管。本研究通過觀察MSCs移植于大鼠缺血心肌后，心臟早發(fā)基因GATA－4 mRNA的表達，探討干細胞向心肌細胞分化的分子基礎(chǔ)，并為深入研究干細胞移植機制提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量 （130±20）g，造模大鼠體質(zhì)量（240±20） g，均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。動物許可證號：SCXK （湘）2009－0004。

1.1.2 試劑 培養(yǎng)基 L－DMEM，美國 GIBCO 公司；特級胎牛血清，北京Hyclone公司；5－氮胞苷，美國Sigma公司； FITC 標(biāo)記 CD11b、CD45、CD90抗體，美國SERANTEC公司；Trizol，美國 Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒，加拿大Fermentas公司；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物，Invitrogen公司。

1.1.3 引物 在NCBIGenbank公布的引物序列，使用Primer Premier5.0進行設(shè)計。由Invitrogen公司合成。見表1。

表1 PCR引物序列及擴增目的片段大小

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離與培養(yǎng) 雄性SD大鼠頸椎脫臼法處死，在75%乙醇中浸泡10 min。在無菌條件下快速取脛骨和股骨，去除周圍組織，切除脛骨和股骨兩端，用DMEM液反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗液收集于離心管中，1 500 r／min離心5 min，棄上清液。加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，細胞計數(shù)后以109／mL密度接種于50 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和濕度、含體積分數(shù)為0.05的CO2孵育箱中培養(yǎng)。48 h后棄懸浮液，首次換液。以后每2 d換液1次。

1.2.2 MSCs的傳代及純化 待原代培養(yǎng)的細胞增殖在瓶底融合基本達到80%左右時，用0.25%胰酶消化細胞后，加培養(yǎng)液終止消化并反復(fù)吹打貼壁細胞，制成單細胞懸液，按1∶2傳代培養(yǎng)，并標(biāo)記為P2，以后每天觀察細胞的生長情況，直至貼壁細胞彼此融合達到80%左右時，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳至第4代。

1.2.3 MSCs 的鑒定 取第 4 代 MSCs，0.25%胰酶消化后配制成細胞懸液，1%BSA封閉液10 min，PBS洗滌3次，加入FITC熒光標(biāo)記的抗CD11b、CD45、CD90抗體，對照組加 PBS，4 ℃孵育 30 min，1 500 r／min離心 5 min，PBS沖洗 3次，以 1%多聚甲醛固定，采用FACScan流式細胞儀檢查細胞表面抗原。

1.2.4 大鼠MSCs細胞懸液配制 用胰蛋白酶消化后離心收集細胞，計數(shù)，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，配制成3×106／100μL濃度的細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 動物造模 取健康清潔級雄性SD大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周。隨機取8只作為空白組，取8只作為假手術(shù)組，其余作為模型組。參考文獻方法［4］將缺血心肌組大鼠腹腔麻醉，仰臥位固定，呼吸機呼吸，行心電監(jiān)測，左胸縱切口分層開胸，在肺動脈圓錐和左心耳之間，距左冠狀動脈起始2 mm處5～0號無創(chuàng)傷絲線結(jié)扎左冠脈前降支，使左室前壁失去原有光澤而變蒼白，出現(xiàn)搏動減弱，心電監(jiān)測見肢體導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高，隨后出現(xiàn)I導(dǎo)聯(lián)和aVL導(dǎo)聯(lián)J點明顯抬高，提示大鼠AMI造模成功。

1.2.6 分組處理 ①模型組 將造模成功的大鼠結(jié)扎30 min后，于梗死區(qū)邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100μL的MSCs細胞懸液 （含細胞數(shù)3×106），常規(guī)關(guān)閉胸腔。術(shù)后腹腔注射青霉素預(yù)防感染，單籠飼養(yǎng)。②假手術(shù)組 給大鼠開胸后，只穿線不做結(jié)扎。30 min后，與模型組相同注射部位的3個位點直接注入共100μL的MSCs細胞懸液，隨后的處理同模型組。③空白對照組 給大鼠開胸后，與模型組相同注射部位的3個位點直接注入共100μL的MSCs細胞懸液，隨后的處理同模型組。各組28 d后處死，取出心臟切下約100 mg放入冷凍管保存在液氮中備用。

1.2.7 檢測GATA－4mRNA的表達 ①組織總RNA的提取，整個提取操作過程要在低溫?zé)o菌進行。取100 mg組織剪碎，加Trizol試劑1 mL，抽吸混勻，室溫靜置10 min；加三氯甲烷0.2 mL，混勻，室溫靜置 10 min；4 ℃，12 000 r／min 離心 10 min；仔細吸取上層水相，移入另一管中，加0.5 mL異丙醇，置室溫 10 min；4 ℃，12 000 r／min 離心 10 min；加 75%乙醇1 mL混勻，充分洗滌沉淀；4℃，7 500 r／min離心5 min；棄去上清液，室溫靜置5 min，用40μL水重懸，貯存于－70℃?zhèn)溆?。②?jīng)電泳鑒定其完整性后，利用紫外分光光度計測定A260與A280的比值，并計算其濃度。③mRNA的反轉(zhuǎn)錄cDNA合成，在 EP 管中加入模板 RNA3μg，oligo （dT）18 primer 1μL加至11μL，離心30 s；65℃水浴5 min后，立刻0℃冰水浴1 min；短暫離心后，冰上操作：加入 4 μL 5×First－Strand Reaction Buffer，1uL MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶；離心30 s，37℃水浴60 min進行逆轉(zhuǎn)錄；70℃水浴5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，－20℃保存，或立即進行PCR。④PCR擴增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，采用的引物同前述所用引物，25μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，進入PCR循環(huán)，94℃變性30 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。⑤PCR產(chǎn)物電泳鑒定，用2%瓊脂糖凝膠為載體，上樣量為12μL，電壓為60 mV，電泳60 min后，置凝膠掃描儀呈像系統(tǒng)下用圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集，每幅圖像使用Image－Pro Plus 6.0軟件編制宏按統(tǒng)一原則進行分析測量。掃描分析GATA－4、內(nèi)參β－actin的光吸收差值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MSCs表面抗原的鑒定結(jié)果

應(yīng)用FACScan流式細胞儀檢查細胞表面抗原CD11b和CD45陽性細胞率均達到98%以上，CD90陽性率小于2%。結(jié)果顯示細胞均一性較好，純度較高。見圖1。

圖1 大鼠MSCs細胞CD11d，CD45和CD90表達流式細胞記錄圖

2.2 RNA的鑒定

提取的心肌組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，所有樣品OD260／OD280值均在1.7以上，表明其純度符合要求。

2.3 MSCs移植缺血心肌后GATA-4 mRNA的表達

用GATA-4 mRNA基因序列設(shè)計的特異性引物進行的RT-PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳分離表明，MSCs移植AMI模型組和模型對照組心肌后28 d的大鼠心肌中存在GATA-4 mRNA的表達，電泳圖上見一683 bp條帶；而空白對照組的心肌中未檢出GATA-4 mRNA的表達，對其IOD值半定量分析，模型組高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2和表2。

圖2 MSCs移植缺血心肌后GATA-4 mRNA-RT-PCR電泳圖譜

表2 MSCs移植缺血心肌后GATA-4 mRNA的表達（n=8，x±s）

3 討論

MSCs具有保持未分化特性無限增殖的能力，并且能夠分化為包括心肌細胞在內(nèi)的各種類型的細胞［5］。GATA-4是GATA基因家族的重要成員之一，含有高度保守的DNA結(jié)合域，此結(jié)構(gòu)域由2個鋅指結(jié)構(gòu)序列構(gòu)成。GATA-4在心臟早期便開始表達，并在心肌和心臟其他組織中持續(xù)表達。生物學(xué)的研究表明GATA-4基因在心肌發(fā)生中扮演重要角色，是MSCs向心肌細胞分化的重要啟動基因和心臟前體細胞的最早標(biāo)志之一。

心臟的發(fā)育是具有時間和空間協(xié)調(diào)一致性的復(fù)雜遺傳過程，主要由細胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達進行精確調(diào)控。干細胞橫向分化的機制與誘導(dǎo)心臟發(fā)生的分子調(diào)控機制密切相關(guān)。本研究應(yīng)用RT-PCR檢測技術(shù)定量分析了心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4 mRNA基因在MSCs移植后的表達差異。結(jié)果顯示，空白對照組的心肌中未檢出GATA-4 mRNA的表達，模型組高于其他兩組。說明MSCs在進入缺血心肌環(huán)境后，細胞內(nèi)的心肌特異轉(zhuǎn)錄過程被再次激活，確立了向心肌細胞分化的方向，GATA-4活化后會導(dǎo)致下游調(diào)控基因級聯(lián)式激活，最終合成特異靶蛋白。因此GATA-4在心臟發(fā)育過程中的作用可能是通過調(diào)控許多心臟結(jié)構(gòu)基因的表達，包括心臟肌球蛋白重鏈、心肌鈣蛋白C等，以及通過其鋅指結(jié)構(gòu)與其他心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子等相互作用形成復(fù)合物發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而調(diào)節(jié)心臟發(fā)育［6-7］。

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