李建政，高晨晨，2，張立國，劉 崇，金 羽，張 巖

(1.哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱，ljz6677@163.com;2.國家城市給水排水工程技術研究中心，300074天津)

傳統(tǒng)理論認為，產(chǎn)甲烷階段是厭氧消化的限制步驟[1].然而，有研究表明，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝對厭氧消化過程的限制作用要大于產(chǎn)甲烷菌群的產(chǎn)甲烷代謝[2－3]，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌代謝活性的增強，有望使厭氧生物處理系統(tǒng)的效能得到顯著提高[4－5].向厭氧生物處理系統(tǒng)中投加產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌或產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營共培養(yǎng)體則是達到這一目的的有效手段之一.產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌對生長條件有較嚴格的要求，其純培養(yǎng)物很難得到[6－7].比較而言，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體的篩選和培養(yǎng)則相對容易.然而，目前關于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體的研究報道還十分匱乏[8－11]，如何有效地篩選和培養(yǎng)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體是需要解決的首要問題.在前期研究中[12]，以處理高質量濃度有機廢水的厭氧折流板反應器(ABR)中的活性污泥為樣品，分離得到一種產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸共培養(yǎng)體7－m－2a.本文從產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的生理生態(tài)習性入手，研究了7－m－2a在不同碳源、氮源及不同質量濃度泛酸、鈣、鐵、鎂離子條件下的生長代謝狀況，優(yōu)化了培養(yǎng)基，為其擴大培養(yǎng)并從中分純產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌株奠定基礎.

1 實驗

1.1 菌種及其來源

研究采用的產(chǎn)乙酸互營共培養(yǎng)體7－m－2a，是以丙酸為底物的選擇性培養(yǎng)基，從本實驗室運行的ABR厭氧活性污泥中分離得到，對丙酸具有較強的降解和轉化能力.該共培養(yǎng)體含有氧化丙酸的專性互營質子還原菌Desulfotomaculum sp.Iso－W2，其伴生菌是能利用甲酸鹽和H2/CO2的Uncultured bacterium 054E12－B－DI－P58 和Sedimentibacter sp.JN18－A14－H.

1.2 培養(yǎng)基

其中，微量元素液(1 L):MnSO4·7H2O 0.01 g，ZnSO4·0.2 g，AlK(SO4)20.01 g;維生素液(1 L):鈷氨素0.01 g，抗壞血酸 0.025 g，核黃素 0.025 g，檸檬酸0.02 g，吡多醛 0.05 g，葉酸 0.01 g，對氨基苯甲酸 0.01 g，肌酸 0.025 g，刃天青(0.2%)0.2 mL，半胱氨酸 1 g，pH 7.0.

丙酸質量濃度梯度培養(yǎng)基:基礎培養(yǎng)基中的丙酸鈉質量濃度為 2.5、5、10、15、20、25 g/L，其他成分不變.

酵母膏培養(yǎng)基:將基礎培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和NH4Cl去除，其他成分不變.胰蛋白胨培養(yǎng)基:將基礎培養(yǎng)基中的酵母膏和NH4Cl去除，其他成分不變.胰蛋白胨－酵母膏培養(yǎng)基:將基礎培養(yǎng)基中的酵母膏和胰蛋白胨質量濃度都調(diào)節(jié)為0.5 g/L，同時去除NH4Cl，其他成分不變.氯化銨培養(yǎng)基:去除基礎培養(yǎng)基中的酵母膏和胰蛋白胨，其他成分不變.復合氮源培養(yǎng)基:將基礎培養(yǎng)基中的胰蛋白胨、酵母膏和 NH4Cl用量均調(diào)節(jié)為0.33 g/L，其他成分不變.

鐵離子培養(yǎng)基:向基礎培養(yǎng)基中投加一定量的FeC12配制而成.培養(yǎng)基中的Fe2+質量濃度，根據(jù)研究需要分別調(diào)節(jié)為 44、66、88、110和132 mg/L.無鈣培養(yǎng)基:將基礎培養(yǎng)基中的CaCl2去除，其他成分不變.鎂離子培養(yǎng)基:向基礎培養(yǎng)基中投加一定量的MgCl2配制而成，培養(yǎng)基中的Mg2+質量濃度，根據(jù)研究需要分別調(diào)節(jié)為13、25、38、50和63 mg/L.泛酸培養(yǎng)基:向基礎培養(yǎng)基中投加一定量的泛酸，根據(jù)研究需要，將其質量濃度分別調(diào)節(jié)為10、20、30、40 和 50 mg/L.

1.3 靜態(tài)實驗方法

取容積為25 mL的厭氧管，注入10 mL的液體培養(yǎng)基，充氮脫氧，封蓋，滅菌;在超凈工作臺(SW－CJ－1G，蘇州凈化設備有限公司)上，用無菌注射器取7－m－2a菌懸液(OD600nm為0.8左右)3 mL接種;置于恒溫培養(yǎng)箱(PYX－DHS，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)中38℃培養(yǎng)30 d.每個培養(yǎng)條件均采用3只厭氧管進行平行試驗.

1.4 分析項目與方法

pH采用PHS－25型酸度計測定.發(fā)酵氣產(chǎn)量采用注射器釋放并劑量，液相末端產(chǎn)物和發(fā)酵氣成分采用氣相色譜儀檢測[4].菌懸液細胞密度采用UV2300型分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)，以未接種的培養(yǎng)液作為空白對照，于波長600 nm處測定吸光度(OD).反應混合液的OD值用于反映菌體的增殖情況.

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

生長代謝指標乙酸產(chǎn)量、氫氣產(chǎn)量、丙酸降解速率以及OD600nm均取3個平行測試的平均值，其標準偏差采用excel軟件中的STDEV函數(shù)計算.

其中，乙酸產(chǎn)量、氫氣產(chǎn)量和OD600nm均為培養(yǎng)30 d后的檢測值減去初始時刻的檢測值，而丙酸降解速率則以丙酸累積消耗量除以培養(yǎng)時間30 d而獲得.

2 結果與討論

2.1 丙酸質量濃度對7－m－2a菌群生長代謝的影響

調(diào)節(jié)基礎培養(yǎng)基中的丙酸鈉質量濃度為2.5、5、10、15、20、25 g/L，分別對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體7－m－2a進行30 d的培養(yǎng).結果(表1)顯示，培養(yǎng)基中丙酸的質量濃度對7－m－2a的生長代謝有比較明顯的影響.在丙酸鈉質量濃度小于10 g/L時，7－m－2a菌群的生長代謝水平隨著丙酸鈉質量濃度的升高而呈現(xiàn)上升趨勢，并在丙酸鈉質量濃度為10 g/L時達到最高，其丙酸降解率和OD值分別為786 mg/(L·d)和1.6，乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為2 749 mg/L和249 mL/L.當丙酸鈉質量濃度增加到10 g/L以上的水平時，7－m－2a菌群的生長代謝則呈現(xiàn)下降趨勢.因此，對于菌群7－m－2a的培養(yǎng)，采用10 g/L的丙酸鈉質量濃度是比較適宜的.

表1 丙酸質量濃度對7－m－2a生長代謝的影響

2.2 氮源對7－m－2a菌群生長代謝的影響

氮是細菌生長代謝所必須的大量元素.對于特定的微生物，其對不同氮源的利用效率存在顯著差異.為尋求培養(yǎng)7－m－2a菌群的最佳氮源，在基礎培養(yǎng)基的基礎上，分別探討了氯化銨、酵母膏、胰蛋白胨、胰蛋白胨－酵母膏、胰蛋白胨－氯化銨、胰蛋白胨－酵母膏－氯化銨等單一氮源和復合氮源對7－m－2a菌群生長代謝的影響，結果如表2所示.研究表明，以胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨調(diào)配成的混合氮源對7－m－2a菌群的生長代謝最為有利，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，丙酸降解速率、菌群增殖量(OD600nm)、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別達到 870 mg/(L·d)、1.21、3 802 mg/L 和245 mL/L.而以酵母膏為唯一氮源時，7－m－2a的生長代謝最不理想，培養(yǎng)結束時，其丙酸降解率、OD600nm、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為862 mg/(L·d)、0.83、3 504 mg/L 和 230 mL/L.

表2 氮源對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.3 Fe2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

許多氧化還原酶中都有鐵離子，它們作為酶的輔因子起著電子傳遞的功能.采用向基礎培養(yǎng)基中加入不同質量濃度 FeCl2的方式，探討了Fe2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響.

結果(表3)表明，F(xiàn)e2+對7－m－2a菌群的生長代謝具有顯著影響.培養(yǎng)基中Fe2+質量濃度在44～88 mg/L時，菌群7－m－2a的生長狀況和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸能力隨著Fe2+質量濃度的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，并在Fe2+質量濃度為88 mg/L時表現(xiàn)出最佳的生長代謝能力，在此條件下經(jīng)30 d的培養(yǎng)，其丙酸降解速率、OD600nm、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別達1 019 mg/(L·d)、2.2、3 909 mg/L 和 266 mL/L.而當培養(yǎng)基中的Fe2+質量濃度繼續(xù)增加時，7－m－2a的生長代謝則表現(xiàn)出了下降趨勢，說明過量的Fe2+會對菌群的生長產(chǎn)生抑制作用.分析認為，F(xiàn)e2+促進7－m－2a菌群生長代謝的主要原因可能在于其參與了鐵氧還原蛋白的合成，而鐵氧還原蛋白是微生物產(chǎn)氫代謝的重要輔酶.Fe2+可以形成Fe－S原子簇為產(chǎn)氫反應提供電子，并激活氫酶，F(xiàn)e2+的缺少可導致細菌甲酸裂解酶合成不足，進而抑制了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝[13].

表3 Fe2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.4 Ca2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

如表4所示，培養(yǎng)基中Ca2+的有無對7－m－2a菌群的增殖影響并不顯著，但在添加1 g/L CaCl2的培養(yǎng)基中，7－m－2a菌群的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝能力明顯高于不含Ca2+的培養(yǎng)基.在含Ca2+培養(yǎng)基中經(jīng)30 d的培養(yǎng)，其乙酸生成量和產(chǎn)氫量分別為3 391 mg/L和259 mL/L，丙酸的平均降解速率為889 mg/(L·d);而在無Ca2+的培養(yǎng)基中，其乙酸生成量和產(chǎn)氫量分別為3 110 mg/L和243 mL/L，丙酸的平均降解速率為858 mg/(L·d).顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CaCl2在液體培養(yǎng)基中大多以結晶顆粒的形式存在，絕大多數(shù)菌體則聚集在這些顆粒表面，以游離狀態(tài)存在的菌體數(shù)量很少.對于這一現(xiàn)象需要給予辯證分析:培養(yǎng)基中添加適量的Ca2+，對于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體的培養(yǎng)是有利的，而要從中分離和純化產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌，Ca2+的添加則是一個不利因素.

表4 Ca2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.5 Mg2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

Mg2+是微生物生長的必要物質，是許多酶的激活劑，因而添加適量的Mg2+可能會對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌活性的提高具有重要作用[14].通過向基礎培養(yǎng)基中添加不同劑量的MgC12，考察了Mg2+質量濃度對7－m－2a菌群生長代謝的影響.

結果(表5)表明，較低的Mg2+質量濃度對7－m－2a菌群的生長和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝具有刺激作用，而Mg2+質量濃度較高時則表現(xiàn)為一定程度的限制作用.在13～63 mg/L的質量濃度范圍內(nèi)，7－m－2a菌群在 Mg2+質量濃度為38 mg/L時表現(xiàn)出了較高的生長和代謝活性，在培養(yǎng)30 d后，其丙酸降解速率、OD600nm、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為 908 mg/(L·d)、1.58、2 939 mg/L和 291 mL/L.

表5 Mg2+對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.6 泛酸對7－m－2a菌群生長代謝的影響

泛酸在微生物體內(nèi)主要以輔酶(CoA)的形式參與糖、脂類、蛋白質的代謝，CoA有轉移酰基的重要作用，泛酸缺乏時，過氧化物酶系的脂肪酸β－氧化就會受到抑制，從而進一步影響到產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的生長代謝.因而，在培養(yǎng)基中適量添加泛酸，將有助于提高產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的代謝活性.實驗結果(表6)表明，低劑量的泛酸對7－m－2a菌群的生長代謝具有刺激作用.在質量濃度為10～50 mg/L的范圍內(nèi)，7－m－2a菌群在泛酸質量濃度為30 mg/L時所表現(xiàn)出的生長代謝活性最高，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，其丙酸降解速率、OD、乙酸和氫氣產(chǎn)量分別為910 mg/(L·d)、1.99、3 779 mg/L和250 mL/L.而當泛酸質量濃度大于或小于30 mg/L時，7－m－2a菌群生長代謝水平均有不同程度的降低.

表6 泛酸對7－m－2a菌群生長代謝的影響

2.7 各項最優(yōu)指標對7－m－2a菌群的綜合影響

根據(jù)2.1至2.6的實驗結果，對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體7－m－2a的基礎培養(yǎng)基進行優(yōu)化，即將其中的丙酸鈉、Fe2+和Mg2+的質量濃度分別調(diào)整為10、88和38 mg/L，以胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨為混合氮源(分別為0.33 g/L)，同時添加30 mg/L的泛酸，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為7.采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，在38℃下培養(yǎng)30 d，7－m－2a菌群對丙酸的降解速率為998 mg/(L·d)，乙酸生成量達3 947 mg/L，產(chǎn)氫量為295 mL/L，反應混合液的OD600nm達2.96.與各單因子的實驗結果(表1～6)比較可見，在優(yōu)化條件下，7－m－2a菌群對丙酸的降解速率、乙酸生成量、產(chǎn)氫量以及菌體增殖量(OD600nm)要優(yōu)于丙酸質量濃度、氮源、Mg2+和泛酸等單因子條件下的培養(yǎng)結果.以Fe2+為單影響因素的培養(yǎng)實驗中(表3)，獲得了1 019 mg/(L·d)的丙酸降解速率，這一結果高于優(yōu)化條件下的998 mg/(L·d)，但諸如乙酸生成量、氫氣生成量以及菌體增殖情況等均不如在優(yōu)化條件下的培養(yǎng)效果好.總體而言，經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基比較適宜7－m－2a菌群的生長代謝.

3 結論

1)對于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體7－m－2a的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中適量添加 Fe2+、Mg2+、Ca2+和泛酸可有效提高菌群的代謝活性.優(yōu)化后培養(yǎng)基成分為，酵母膏 0.33 g，胰蛋白胨 0.33 g，微量元素液 10 mL，維生素液10 mL(添加泛酸 30 mg/L)，1 000 mL，pH 7.0，培養(yǎng)溫度采用38℃.

2)在優(yōu)化培養(yǎng)基中38℃培養(yǎng)30 d，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌互營共培養(yǎng)體7－m－2a對丙酸的降解速率可達 998mg/(L·d)，乙酸生成量為3 947 mg/L，產(chǎn)氫量為295 mL/L，反應混合液的OD600nm達 2.96.

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