金圣華 劉學(xué)軍 張 禮（南京航空航天大學(xué) 計算機科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 2006）

2（淮陰工學(xué)院 計算機工程學(xué)院，淮安 223001）

引言

隨著人類基因組計劃的完成，使人類及其他多種生物的核苷酸構(gòu)成得以測序。科學(xué)家們研究的重點轉(zhuǎn)為分析這些基因的功能以及基因之間的相互關(guān)系，希望通過認(rèn)識基因互相作用的機理來揭示生命的奧秘，進(jìn)而延長人類的壽命，提高人類的生活質(zhì)量。為了研究基因之間復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，近10多年來，人們采用高通量的方法，在基因組水平上大規(guī)模測量基因的表達(dá)水平?；陔s交技術(shù)的基因芯片［1-2］以其高度并行化、多樣化、微型化和自動化的特征快速地發(fā)展起來，在生命科學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前，對基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析主要分為兩個步驟：基因芯片實驗的原始數(shù)據(jù)分析為每個基因計算一個表達(dá)值，也稱為探針級別數(shù)據(jù)分析；后續(xù)分析以此作為輸入數(shù)據(jù)，進(jìn)行多種目的的分析工作，如尋找差異基因、聚類、分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等。因此，原始數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確程度，對后續(xù)分析起著至關(guān)重要的作用。

基因芯片技術(shù)出現(xiàn)的時間較長，技術(shù)相對成熟，但是采用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)水平測量存在一個主要的問題：由于實驗中非特異性雜交的存在，使得實驗結(jié)果包含較高噪聲，影響了基因表達(dá)水平的計算。過去幾年的研究表明，可以采用各種數(shù)學(xué)模型對噪聲來源進(jìn)行模擬，以便有效去除噪聲對后續(xù)數(shù)據(jù)分析的影響。本研究使用目前使用較為廣泛的美國Affymetrix公司制備的基因芯片GeneChip?，對原始實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析研究。首先，利用Affymetrix公司提供的一個標(biāo)準(zhǔn)的拉丁方spike-in數(shù)據(jù)集［3］，分析原始數(shù)據(jù)的噪聲特征，研究芯片的物理結(jié)構(gòu)和噪聲之間的關(guān)系，歸納出相應(yīng)的表示方式，將此對應(yīng)關(guān)系應(yīng)用到目前一個先進(jìn)的計算基因表達(dá)水平的概率模型mmgMOS中［4］；最后采用拉丁方spike-in實驗數(shù)據(jù)集及一個真實的老鼠胚胎數(shù)據(jù)集［5］，對改進(jìn)的mmgMOS模型進(jìn)行實驗驗證。實驗結(jié)果顯示，考慮了芯片物理結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)噪聲的關(guān)系，可以有效地提高mmgMOS方法對基因表達(dá)水平計算的精度和效率。

1 基因芯片實驗原理

基因芯片是在一個方形的固體平面上固定大量稱之為探針的短序列，探針與基因或基因的產(chǎn)物等在一定條件下發(fā)生雜交反應(yīng)。芯片實驗是從生物樣本中提取mRNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后與芯片上的探針進(jìn)行雜交，把配對后的芯片進(jìn)行沖洗、掃描，得到探針?biāo)降脑紨?shù)據(jù)。目前，廣泛使用的芯片主要是美國Affymetrix公司的寡聚核苷酸基因芯片。Affymetrix公司使用原位合成的方法，設(shè)計了獨特的PM-MM探針方案：每一個基因在芯片上對應(yīng)一個或幾個探針組，每個探針組又由十幾對25mer的探針對組成，每探針對包括兩個探針，其中一個是完全匹配（PM，perfect-match）的探針，另一個是序列中間有一個堿基錯配（mis-match，MM）的探針［2］。每個探針組在實驗結(jié)果中，PM和MM探針的熒光灰度值代表所對應(yīng)基因的表達(dá)水平。根據(jù)雜交原理，探針理論上只與樣本中堿基互補的mRNA單鏈進(jìn)行雜交，這種綁定稱為特異性雜交（specific hybridization）。但是，實際實驗中與探針序列不完全匹配的mRNA樣本序列也可能與該探針雜交綁定，稱為非特異性雜交（non-specific hybridization）。GeneChip?中MM探針的引入，是為了測量對應(yīng)PM探針的非特異性雜交信號。

2 標(biāo)準(zhǔn)拉丁方spike-in實驗數(shù)據(jù)集

該數(shù)據(jù)集由美國Affymetrix公司提供，以便研究和比較探針級別數(shù)據(jù)分析方法。采用HGU-133基因芯片，含有42個spike-in基因、14組標(biāo)靶濃度下重復(fù)3次的實驗數(shù)據(jù)，以拉丁方實驗?zāi)Ｊ降贸龅臄?shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集中每個基因芯片為712×712矩陣，包含506 944個探針，一共有22 300個探針組。第一組實驗的樣本濃度順序為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512皮摩爾（pM），以后每組實驗輪轉(zhuǎn)一下濃度順序。例如，第二組實驗的樣本濃度順序為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、0pM。14組已知轉(zhuǎn)錄組濃度的信息表提供了14個相關(guān)探針組的真實表達(dá)水平值，從而成為評價不同基因表達(dá)水平算法性能的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 在Affymetrix HGU-133 spike-in數(shù)據(jù)集中，204563_s_at探針組有11個探針對其實驗結(jié)果和樣本濃度的對應(yīng)關(guān)系（實線代表PM探針的對數(shù)灰度值，虛線代表MM探針的對數(shù)灰度值）Fig.1 The logarithm of the intensities for the 11 probe pairs related to probe-set 204563_s_at in Affymetrix HGU-133 spike-in dataset versus the logarithm of transcript concentration（The solid lines represent PM intensities and the dotted lines represent MM intensities）

3 原始數(shù)據(jù)噪聲特征分析

在spike-in數(shù)據(jù)集中，隨機選取一個spike-in探針組204563_s_at，其樣本濃度和探針灰度值之間的關(guān)系見圖1。該探針組有11個探針對，實驗濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512pM。

由實驗結(jié)果可知，當(dāng)樣本的濃度增大時，PM和MM探針的灰度值都隨之增加，這意味著PM和MM探針均測量到對應(yīng)基因的特異性雜交信號，但PM探針的灰度增加要比相應(yīng)的MM探針的灰度大；當(dāng)樣本濃度降低時，同一探針對的PM和MM的灰度是很接近的，少部分MM探針的灰度值大于PM探針的灰度值。有研究者發(fā)現(xiàn)，這部分探針對應(yīng)整個數(shù)據(jù)集的10％～30％［6］。另外，探針灰度值和樣本濃度并不總是成線性關(guān)系，特別在低濃度的時候。這是由于樣本濃度較低時，探針灰度值中測得的特異性雜交信號較少，非特異性雜交和背景噪聲對實驗結(jié)果影響較大，所以對基因表達(dá)水平的計算比較困難。由以上分析可知，MM探針也測量到對應(yīng)基因的真實信號，因此進(jìn)行以下假設(shè)，有

式中：pm和mm分別為PM和MM探針在實驗結(jié)果中對應(yīng)的圖像灰度值，代表待測相應(yīng)基因的該mRNA片段的轉(zhuǎn)錄水平；s為特異性雜交信號，即與PM探針完全匹配的雜交信號；b為非特異性雜交信號和背景噪聲。

有學(xué)者通過實驗驗證，相比非特異性雜交信號，特異性雜交信號的背景噪聲比較小，可以忽略，也可預(yù)先去除［11］。在式（1）中，系數(shù)Φ∈（0，1）。該假設(shè)允許MM探針也測量到部分特異性雜交信號，這與圖1觀測到實驗結(jié)果是相符的。同時假設(shè)，綁定在MM探針上的特異性雜交信號小于PM探針上的特異性雜交信息。當(dāng)樣本濃度較大時，由于探針灰度中的特異性信號較大，所以可將此時的非特異性雜交信號和背景噪聲忽略不計，則式（1）可近似為

此時，可認(rèn)為log2mm≈log2Φ+log2pm或Φ≈mm/pm。當(dāng)樣本濃度較大時，log2pm與log2mm曲線近似平行，之差即為log2Φ。由圖1還可發(fā)現(xiàn)，每個探針對應(yīng)的log2Φ大小不盡相同，希望能夠找到不同探針?biāo)鶎?yīng)的Φ，以便得到MM探針上測量到的特異性雜交信號的比例。

有研究者發(fā)現(xiàn)，Affymetrix基因芯片探針中央核苷酸序列和相應(yīng)MM探針與PM探針灰度比值存在一定關(guān)系［7-8］。根據(jù)GeneChip?設(shè)計原理，PM和MM兩個探針結(jié)構(gòu)上的差別僅是中央一個核苷酸是錯配的。從spike-in數(shù)據(jù)集中，提取濃度值大于64pM的spike-in基因所對應(yīng)的探針灰度值，得到探針中央一個核苷酸對應(yīng)的MM探針灰度與PM探針灰度比值分布的直方圖，如圖2所示。由于提取數(shù)據(jù)所對應(yīng)的樣本濃度較高，所以可以忽略非特異性雜交和背景噪聲的影響，該直方圖可以近似給出Φ的分布情況。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，中央核苷酸C和G的Φ分布較相似，這意味著探針中央一個核苷酸所對應(yīng)的Φ分布不惟一，因此選取探針中央3個核苷酸來研究核苷酸序列和Φ之間的關(guān)系。從spike-in數(shù)據(jù)集中提取濃度值大于64pM的基因表達(dá)值，得到探針中央3個核苷酸所對應(yīng)的Φ分布情況，圖3顯示了部分分析結(jié)果。從圖3中可以看出，Φ在大部分情況下小于1，這說明大部分MM探針的灰度值小于PM探針的灰度值，并且Φ的分布因核苷酸組合的不同而明顯不同，表明Φ的分布與中央3個核苷酸序列具有一定相關(guān)性。

圖2 樣本濃度值大于64 pM的探針中央一個核苷酸對應(yīng)MM探針灰度與PM探針灰度的比值直方圖Fig.2 The histogram of the ratio ofmm/pm with identical middle nucleotide within the probe-pairs PM and MM probes are from the sample concentrations are greater than 64 pM

4 對探針級別數(shù)據(jù)分析算法的改進(jìn)

根據(jù)Affymetrix基因芯片原始數(shù)據(jù)的噪聲特性，人們設(shè)計了很多模型來計算基因的表達(dá)值。傳統(tǒng)方法主要有MBEI［9］、RMA［10］和GCRMA［11］等，能夠較為準(zhǔn)確地計算出基因表達(dá)水平，但是大部分僅計算出表達(dá)值而不能提供表達(dá)值的置信區(qū)間給后續(xù)分析。而概率模型在處理基因原始表達(dá)數(shù)據(jù)時［12］，不僅能給出每個基因的表達(dá)值，而且還能給出每個表達(dá)值的置信度，為后續(xù)分析提供更多信息，如BGX［13］、gMOS［14］和mmgMOS。其中，BGX考慮到了MM探針上也測量到特異性雜交信號，但是BGX通過MCMC方法來估計模型中的參數(shù)，因此計算效率比較低，特別是對于低表達(dá)值的基因，需要更多次的迭代。gMOS和mgMOS這兩個模型，利用最大似然估計參數(shù)的方法，提高了計算速度，但是只針對單個芯片，假設(shè)芯片之間沒有相關(guān)性，并且沒有考慮MM探針上也測量到了真實信號，這顯然是不合實際的。mmgMOS模型結(jié)合BGX模型和mgMOS模型的優(yōu)點［15］，同時考慮了相同的探針在不同芯片上具有同樣的相關(guān)性。該模型假設(shè)

圖3 樣本濃度值大于64pM的探針中央3個核苷酸對應(yīng)MM探針灰度與PM探針灰度比值直方圖Fig.3 The histogram of the ratio of mm/pm with identical middle three nucleotides within the probe-pairs.PM and MM probes are from the sample concentrations are greater than 64 pM

式中，pmgjc和mmgjc分別表示芯片c上探針組g的第j個PM和MM探針對的灰度值，sgjc表示特異性雜交信號，bgjc表示非特異性雜交信號和背景噪聲。該模型是將每個芯片上最小探針灰度值近似作為背景噪聲［11］，在應(yīng)用式（3）之前，將其從PM和MM探針灰度中去除，故經(jīng)過背景噪聲矯正，bgjc僅表示非特異性雜交信號。式（3）中Φ∈（0，1），表示MM探針上也測量到了一部分特異性信號。但是，該模型假設(shè)所有探針對具有相同的Φ系數(shù)值，沒有考慮到不同探針灰度值對應(yīng)的Φ是不同的。其中，Φ的求解采用MAP估計與其他參數(shù)進(jìn)行交替迭代，計算效率較低。

通過對原始數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)不同核苷酸序列對應(yīng)不同的MM探針灰度與PM探針灰度的比值（Φ≈mm/pm）。對于探針中央3個核苷酸的64種組合形式，求出每種組合所對應(yīng)的Φk值，k對應(yīng)探針中央3個核苷酸的組合情況。將此對應(yīng)關(guān)系嵌入到mmgMOS中，得到新模型mmgMOSⅡ，有

式中，Φgj是和每個探針組中的每個探針對應(yīng)，取值為中央3個核苷酸的64種可能組合所對應(yīng)的MM探針灰度與PM探針灰度比值之一，同類芯片可以共享該值，表示綁定在該芯片上的每個MM探針特異性雜交信號的比例。

利用此模型，可以消除實驗中MM探針測量到的真實信號對基因表達(dá)水平計算帶來的影響，從而提高基因表達(dá)水平計算的準(zhǔn)確率。其中，Φgj不參與模型的求解，可以通過對實驗數(shù)據(jù)的預(yù)處理而近似得到，消除了原來mmgMOS模型中反復(fù)迭代求解的過程，提高了計算的效率。

5 實驗結(jié)果分析

為了驗證mmgMOSⅡ模型在計算效率和計算精度兩方面的性能，分別采用spike-in數(shù)據(jù)集以及一個真實的老鼠胚胎數(shù)據(jù)集。除了與mmgMOS方法進(jìn)行比較外，因傳統(tǒng)方法MBEI同樣能輸出基因表達(dá)水平的置信區(qū)間，故也與該方法進(jìn)行比較。MBEI采用Affy軟件包中的實現(xiàn)代碼，mmgMOS采用Bioconductor中puma軟件包的實現(xiàn)代碼［16］，mmgMOSⅡ是在mmgMOS的實現(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。

5.1 計算精度

5.1.1 Spike-in數(shù)據(jù)集上的性能比較

對spike-in數(shù)據(jù)集處理，mmgMOSⅡ采用了樣本濃度大于64pM的探針灰度值計算Φk值，mmgMOS對所有探針共享的Φ進(jìn)行優(yōu)化計算，MBEI僅使用PM探針灰度值來計算。圖4顯示了42個spike-in基因利用不同方法求出的基因表達(dá)值和樣本濃度之間的對應(yīng)關(guān)系，采用的數(shù)據(jù)為每個條件下選取3次重復(fù)實驗中的1次測量值。隨著樣本濃度的增大，得到的基因表達(dá)水平對應(yīng)增大，圖4中每條曲線的斜率理論上為1。然而，在樣本濃度較低的情況下，由于mmgMOSⅡ和mmgMOS計算得到的部分基因表達(dá)值小于1，使得對數(shù)表達(dá)值為負(fù)值。而MBEI只使用PM探針灰度值，因此沒有負(fù)表達(dá)值，得到較高的基因表達(dá)水平。取濃度范圍為2、4、8、16、32pM，得基因表達(dá)值和樣本濃度的比值如圖4中的Slope所示。可以看出，mmgMOSⅡ和mmgMOS得到的平均斜率相比于MBEI更接近于1，而mmgMOSⅡ相對于mmgMOS結(jié)果略優(yōu)越。

圖4 42個Spike-in基因在Spike-in數(shù)據(jù)集上利用不同方法求出的基因表達(dá)值和樣本濃度值之間的對應(yīng)關(guān)系。（a）MBEI；（b）mmgMOS；（c）mmgMOSⅡFig.4 Curves of logarithm of gene expression values obtained from different methods，for the 42 spike-in genes in the spike-in data set spike-in against the log transformation of transcription concentrations.（a）MBEI；（b）mmgMOS；（c）mmgMOSⅡ

5.1.2 老鼠胚胎數(shù)據(jù)集上的性能比較

利用GEO（the Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中老鼠胚胎的真實數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步驗證mmgMOSⅡ的性能。老鼠胚胎數(shù)據(jù)集使用Affymetrix Mouse Genome 430 2.0基因芯片，用來判斷Oct4估測基因在老鼠早期胚胎中從單細(xì)胞到多細(xì)胞階段變化過程的規(guī)律。這個數(shù)據(jù)集包括4個實驗條件，每個條件下有3個重復(fù)芯片，每個芯片上包含45 037個探針組。4個條件由測試實驗和對照實驗兩部分組成，其中測試實驗包括注射了Oct4和Ccna2兩個部分，而對照組對應(yīng)著沒有注射的兩部分。在Oct4實驗條件下，總共有42個基因被選擇出來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酵素-聚合酵素連鎖反應(yīng)（qr-PCR）實驗，qr-PCR實驗證明32個差異基因?qū)?yīng)芯片上的93個匹配的探針組。用這93個顯著差異的探針組作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，比較不同基因表達(dá)水平計算方法得到的處理結(jié)果。其中，尋找差異基因處理的方法全部采用PPLR［17］，該方法不但采用基因表達(dá)水平測量值來尋找差異基因，同時還利用了基因表達(dá)水平的置信區(qū)間，更好地利用了原始數(shù)據(jù)中的豐富信息。mmgMOSⅡ分別選取PM探針灰度值大于512和1 024的實驗數(shù)據(jù)來預(yù)計算Φk。為了使不同的處理結(jié)果可以互相做比較，分別選取不同α水平值。這里的α沒有特殊的意義，只是保證每種方法找到的總差異基因個數(shù)為1 254個。

表1中顯示了不同方法找到的與93個PCR實驗驗證的差異探針組一致的差異基因數(shù)。對于MBEI+PPLR方法，測得與qr-PCR數(shù)據(jù)一致的探針組為33個，其一致率為35.5％；對于mmgMOS+PPLR方法，測得與qr-PCR數(shù)據(jù)一致的探針組為38個，其一致率為40.9％；對于mmgMOSⅡ+PPLR方法，在Φk的計算選取PM探針灰度值大于512和1 024的兩種情況下，均檢測到40個，其一致率為43.0％。實驗結(jié)果表明，在真實數(shù)據(jù)集的處理中，mmgMOSⅡ能夠比mmgMOS及傳統(tǒng)方法MBEI顯著降低原始數(shù)據(jù)中噪聲的干擾。

表1 老鼠胚胎真實數(shù)據(jù)集的檢測結(jié)果Tab.1 Results on the real mouse embryo dataset

5.2 計算效率

為了驗證mmgMOSⅡ的計算效率，比較了mmgMOS和mmgMOSⅡ?qū)Σ煌瑪?shù)據(jù)集的處理時間。表2列出兩種方法在不同數(shù)據(jù)集上的計算時間，計算平臺為雙核CPU，主頻2.60GHz，2.0GB內(nèi)存，Windows XP操作系統(tǒng)。

從表2中可以看出，mmgMOSⅡ的計算效率比mmgMOS明顯提高。這是由于mmgMOS需要經(jīng)過多次反復(fù)迭代，才能找到最后的優(yōu)化值Φ，所以耗時比較長，特別是如果初始值的設(shè)置明顯偏離最后的優(yōu)化值，迭代的次數(shù)越多，耗時越長。在實驗中，根據(jù)先驗知識設(shè)置Φ初始值為0.171，spike-in數(shù)據(jù)集Φ的最后優(yōu)化值為0.161 8，老鼠胚胎數(shù)據(jù)集Φ的最后優(yōu)化值為0.118 04，老鼠胚胎數(shù)據(jù)集的芯片個數(shù)少于spike-in數(shù)據(jù)集，但是老鼠胚胎數(shù)據(jù)集卻比實際spike-in數(shù)據(jù)集多耗費了近5h。這主要是由于該數(shù)據(jù)集Φ初始值偏離最終的優(yōu)化值較大。在實際采用mmgMOS處理真實數(shù)據(jù)時，由于Φ的初始值很難確定，故通常引起較長的計算時間。而在mmgMOSⅡ中，利用預(yù)處理得到的探針中3個核苷酸序列和Φ的對應(yīng)關(guān)系，可大大縮短計算時間，提高了計算效率。

表2 mmgMOSⅡ和mmgMOS在老鼠胚胎數(shù)據(jù)集和spikein數(shù)據(jù)集上的計算時間（單位：h）Tab.2 The computation time（in hours）ofmmgMOSⅡandmmgMOS on the spike-in data set and the mouse embryo dataset

6 結(jié)語

本研究分析了Affymetrix基因芯片原始數(shù)據(jù)的噪聲特點，利用基因芯片探針的核苷酸序列和相應(yīng)MM探針與PM探針灰度比值存在的對應(yīng)關(guān)系，改進(jìn)mmgMOS模型中的參數(shù)Φ的計算，最后通過spike-in標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集和老鼠胚胎真實數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗證。實驗結(jié)果證明mmgMOSⅡ能夠提高原模型以及傳統(tǒng)方法對非特異性雜交信號的處理能力。在實際采用mmgMOSⅡ處理真實數(shù)據(jù)集時，可采用灰度值較高的探針數(shù)據(jù)近似預(yù)估計Φ，避免了原方法中的參數(shù)迭代優(yōu)化過程，有效提高了模型的計算效率。

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