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        靈貓方藥物血清體外抗乙肝病毒作用的研究*

        2011-08-31 06:14:30朱曉駿孫學(xué)華高月求
        關(guān)鍵詞:血清

        朱曉駿 孫學(xué)華 李 璐 高月求

        上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科 (上海,200021)

        靈貓方是本院肝病科治療慢性乙型肝炎 (CHB)的常用方劑,本文擬采用血清藥理學(xué)的研究方法[1]來驗(yàn)證其體外抑制乙肝病毒 (HBV)的效果。

        1 材料與方法

        1.1 動物與細(xì)胞株 SD雄性大鼠15只,體重250~300g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。HepG 2.2.15細(xì)胞,由上海公共衛(wèi)生中心惠贈。

        1.2 主要藥品 靈貓方中藥顆粒劑由江陰天江制藥有限公司提供,批號:0912302,醋青皮1.5g(相當(dāng)于生藥9g),黃芪2.25g(相當(dāng)于生藥15g),胡黃連1.5g(相當(dāng)于生藥9g),貓爪草1.5g(相當(dāng)于生藥15g),仙靈脾0.75g(相當(dāng)于生藥15g),女貞子1.5g(相當(dāng)于生藥15g)。

        1.3 主要試劑與儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液:DMEM培養(yǎng)基(GIBCO進(jìn)口分裝);0.25%胰蛋白酶溶液:胰蛋白酶0.25g(Difeo進(jìn)口分裝);小牛血清:杭州四季青生物公司生產(chǎn);SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀:美國Molecular Devices產(chǎn)品。

        1.4 靈貓方含藥血清的制備 將15只成年大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字表法,平均分為3組,每組5只,分別為10倍靈貓方組(簡稱10倍組),5倍靈貓方組 (簡稱5倍組),生理鹽水組(簡稱鹽水組)。大鼠給藥量按照10倍、5倍成人標(biāo)準(zhǔn)體重(50Kg為標(biāo)準(zhǔn)體重)計(jì)算。靈貓方顆粒劑給藥劑量:10倍靈貓方組為0.18g·100g-1d-1,5倍靈貓方組為0.09g·100g-1d-1。各組動物在同等條件下飼養(yǎng),生理鹽水組及中藥組大鼠每日早晚各1次空腹灌胃,連續(xù)3天,末次給藥1小時(shí)后空腹苯巴比妥麻醉,腹主動脈采血,在無菌條件下靜置2小時(shí)以上,3 000rpm離心10~15分鐘分離血清,56℃水浴箱內(nèi)放置30分鐘,應(yīng)用0.22μm微孔膜過濾除菌,分裝,置于 -80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)及檢測 處于對數(shù)生長期的HepG 2.2.15細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞,接種于96孔培養(yǎng)板(2.0 ×104細(xì)胞/孔),分別加入培養(yǎng)液100μl/每孔。在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后換入含藥培養(yǎng)液 (含藥血清用培養(yǎng)液按1∶10稀釋加入培養(yǎng)孔),每72小時(shí)更換新鮮含藥培養(yǎng)液,共3次,換出的細(xì)胞上清液用于檢測HBsAg、HBeAg(酶聯(lián)免疫法)。具體操作如下:①每孔加入待測樣品50μl,設(shè)陰、陽性對照各兩孔,每孔加入陰性對照 (或陽性對照)各50μl,并設(shè)空白對照1孔;②每孔加入酶結(jié)合物50μl(空白對照孔除外),充分混勻,封板,置37℃孵育30分鐘;③棄去孔內(nèi)液體,用洗滌液注滿各孔,靜置5秒,甩干,重復(fù)5次后拍干;④每孔加顯色劑A液、顯色劑B液各50μl,充分混勻,封板,置37℃孵育15分鐘;⑤每孔加入終止液50μl,混勻;⑥用酶標(biāo)儀讀數(shù),取波長450nm,參考波長630nm,先用空白孔校零,然后讀取各孔OD值。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對HBsAg和HBeAg抑制率按下列公式計(jì)算:抑制率=(生理鹽水組OD值 -含藥血清組OD值)×100%/生理鹽水組OD值。OD值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,3組均數(shù)比較采用ANOVA方差分析,P≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 3 組血清對HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中 HBsAg的抑制作用 見表1。分析不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清對HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中的HBsAg抑制率,顯示第6天達(dá)到最高峰,此后下降。

        2.2 3 組血清對HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中HBeAg的抑制作用 見表2。分析不同時(shí)間點(diǎn)含藥血清對HepG 2.2.15細(xì)胞上清液中的HBeAg抑制率,顯示第6天達(dá)到最高峰,此后下降。

        3 討論

        在我國一般人群的HBsAg陽性率為7.18% ,接種與未接種乙型肝炎疫苗人群的 HBsAg陽性率分別為 4.51% 和9.51%[2]。CHB 5年發(fā)生肝硬化的幾率是8% ~20%,發(fā)生肝硬化后5年內(nèi)發(fā)生失代償?shù)膸茁适?0%,代償期的肝硬化5年生存率是80%~86%,失代償期患者的5年生存率是14%~35%,每年在肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生肝細(xì)胞癌是2% ~5%[3]。目前對CHB的治療,主要是選用干擾素和核苷酸類似物,這些藥物對病毒有良好地抑制作用,但存在副作用大、病毒變異,停藥后容易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。而采用中藥可通過免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒等多方面起作用。

        中藥復(fù)方不能直接用于培養(yǎng)細(xì)胞,通過藥物血清驗(yàn)證其對HBsAg、HBeAg的作用,是目前一種簡單可行的方法。HepG 2.2.15細(xì)胞是HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV 全基因序列[4],因能夠穩(wěn)定分泌HBV而廣泛應(yīng)用于體外研究。靈貓方是在補(bǔ)腎法治療CHB的基礎(chǔ)之上,結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立的,我們發(fā)現(xiàn)單純應(yīng)用清熱化濕的方法,治療CHB的效果并不佳,在清熱化濕的同時(shí)應(yīng)用補(bǔ)腎法則往往能提高療效。靈貓方具有補(bǔ)腎和清熱化濕的作用。本實(shí)驗(yàn)證明靈貓方藥物血清能夠抑制HBV,值得進(jìn)一步研究。

        [1]方肇勤主編.實(shí)驗(yàn)中醫(yī)學(xué)[M].第3版,上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2008:212-213.

        [2]梁曉峰,陳園生,王曉軍,等.中國3歲以上人群乙型肝炎血清流行病學(xué)研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2005,26(9):655-658.

        [3]EASL.Clinical Practice Guidelines:Management of chronic hepatitis B[J].Hepatology ,2009,50(2):227-242.

        [4]SELLS MA,CHEN ML,ACS G.Production of hepatitis B virus particles in HepG cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J].PNAS,1987,84(4):1005-1009.

        表13 組血清對HepG 2.2.15細(xì)胞HBsAg抑制作用比較(±s)

        表13 組血清對HepG 2.2.15細(xì)胞HBsAg抑制作用比較(±s)

        與生理鹽水組比較,*P<0.001;與5倍藥物血清組比較,△P>0.05

        組別 n 第3d OD值 抑制率 (%)第6d OD值 抑制率 (%)第9d OD值 抑制率 (%)鹽水組3 1.754 ±0.012 2.876 ±0.011 3.288 ±0.010 5 倍組 3 1.277 ±0.008* 27.2 1.156 ±0.011* 59.8 1.986 ±0.011* 39.6 10倍組 3 1.262 ±0.011*△ 28.0 1.146±0.012*△ 60.1 1.977±0.011*△39.9

        表23 組血清對HepG 2.2.15細(xì)胞HBeAg抑制作用比較(±s)

        表23 組血清對HepG 2.2.15細(xì)胞HBeAg抑制作用比較(±s)

        與生理鹽水組比較,**P<0.01;與5倍藥物血清組比較,△P>0.05

        組別 n 第3d OD值 抑制率 (%)第6d OD值 抑制率 (%)第9d OD值 抑制率 (%)鹽水組3 1.584 ±0.013 2.785 ±0.011 3.326 ±0.009 5倍組 3 1.019 ±0.008** 35.7 1.026±0.013** 63.1 1.889±0.010** 43.2 10倍組 3 1.012±0.010**△ 36.1 1.014±0.0110**△ 66.1 1.8776±0.0094**△43.6

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