江奮霞 張浩 劉緒平 張春華

注射用頭孢他啶為第三代頭孢菌素類抗生素，屬于《中國藥典》二部品種，有較強的抑菌性，故必須采用適當?shù)姆椒ㄏ湟志圆拍苓M行無菌的檢查。本文對該品種的無菌檢查方法進行了方法學研究，通過研究，本樣品可采用薄膜過濾法，用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，沖洗量為每筒500 ml，分5次，100 ml/次，結果表明該方法有效可行。

1 儀器與試藥

YXQ-LS-50SⅡ高壓蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)醫(yī)療器械有限公司);D8523CTL-2W格蘭仕微波爐(順德格蘭仕微波爐電器有限公司);HTY-2000A集菌儀(杭州高德泰林有限公司);SW-CJ-2D凈化工作臺(蘇州凈化有限公司);Heal Force-900C生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司);PYXDHS細菌培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)、MJ-160B霉菌培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)。

試驗菌種:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、生孢梭菌 (Costridium sporogenes)[CMCC(B)64941]、白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉 (Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]，由中國藥品生物制品檢定所提供。

硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、0.1%蛋白胨水溶液，由北京三藥科技開發(fā)公司提供。注射用頭孢他啶為江西東風藥業(yè)股份有限公司提供，批號為090124-1，規(guī)格為1.0 g。

2 方法[1，2]與結果

2.1 菌液制備 取經35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌的新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-7，約為50～100 cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。取經25℃ 培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-6，約為50～100 cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。取經25℃ 培養(yǎng)1周的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物，加5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標準比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，取1 ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4，約為50～100 cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。取經35℃培養(yǎng)18～24 h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5-10-7，含菌數(shù)小于100 cfu/ml，備用。

2.2 供試液制備 按規(guī)定量取供試品，用0.1%蛋白胨水溶液適量溶解，作為供試品溶液。

2.3 無菌檢查法的驗證 采用一次性三聯(lián)濾器，先將濾器用少量稀釋劑潤濕，使稀釋劑順利流出，再將供試品溶液抽入濾器;用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，沖洗總量每筒分別為300，400，500 ml，濾干，將硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、改良馬丁液體培養(yǎng)基100 ml濾入三聯(lián)濾器，加入少于100 cfu的試驗菌，置溫度35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3～5 d逐日觀察結果見表1。

表1 菌落計數(shù)結果表

注射用頭孢他啶無菌檢查法(薄膜過濾法)觀察不同沖洗量，對7株陽性代表菌抑菌的影響，加入適宜液體培養(yǎng)基，并同時做空白對照實驗，置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀擦結果。見表2～8。

表2 人工污染大腸埃希菌結果

表3 人工污染金黃色葡萄球菌結果

表4 人工污染枯草桿菌結果

表5 人工污染銅綠假單孢菌結果

表6 人工污染生孢梭菌結果

表7 人工污染白色念珠菌結果

表8 人工污染黑曲霉菌結果

2.4 結果 從表2～8的結果可以看出，500 ml/筒沖洗，可使7株陽性菌生長良好。取規(guī)定量供試品，以適量0.1%蛋白胨水溶液溶解，按上述薄膜過濾法沖洗，7株陽性菌均可以正常生長，表明樣品在經過每筒500 ml的沖洗消除了抗菌活性。經過無菌檢查的方法學驗證，本品無菌檢查可采用薄膜過濾法，用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，沖洗量為每筒500 ml，分 5 次，100 ml/次。

3 討論

頭孢他啶為第三代頭孢菌素類抗生素。對大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌等腸桿菌科細菌和流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌等有高度抗菌活性，對硝酸鹽陰性桿菌、產堿桿菌等亦有良好抗菌作用[3]。對于細菌產生的大多數(shù)β-內酰胺酶高度穩(wěn)定，故其對上述革蘭陰性桿菌中多重耐藥菌株仍可具抗菌活性。肺炎球菌、溶血性鏈球菌等革蘭陽性球菌對頭孢他啶高度敏感，但本品對葡萄球菌僅具中度活性，腸球菌和耐甲氧西林葡萄球菌則往往對本品耐藥。本品對消化球菌和消化鏈球菌等厭氧菌具一定抗菌，但對脆弱擬桿菌抗菌作用差。說明，本品的抗菌性較強。

鑒于頭孢他啶有較強抗菌性，但又不能確定其對無菌檢查有多大影響，故無菌檢查采用依次漸進的方法來摸索合適的沖洗量和沖洗方法。根據(jù)對其抗菌性的分析，選擇了大腸埃希菌為敏感菌株先進行試驗，沖洗量為0.1%蛋白胨水溶液每筒300、400 ml時，陽性菌不能正常生長，沖洗量為0.1%蛋白胨水溶液每筒500 ml時，7株陽性菌均能正常生長。經過驗證，本樣品可以采用全封閉薄膜過濾法檢查，沖洗量為0.1%蛋白胨水溶液每筒500 ml，分5次，100 ml/次。

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生部藥典委員會編.中華人民共和國藥典.第二部.北京:化學工業(yè)出版社，2005.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生部藥典委員會編.中華人民共和國藥典臨床用藥須知，化學藥和生物制品卷.人民衛(wèi)生出版社，2005.