陳瑞瑞， 崔金杰， 李國(guó)清＊

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院／教育部病蟲害綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所／棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng) 455000）

青霉素影響甜菜夜蛾幼蟲耐受幾種蘇云金桿菌晶體蛋白的能力

陳瑞瑞1， 崔金杰2， 李國(guó)清1＊

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院／教育部病蟲害綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所／棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng) 455000）

本文評(píng)估了Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca蛋白對(duì)甜菜夜蛾2齡幼蟲的毒力，其LC50分別為0.442 5、0.675 7μg／cm2和0.150 2μg／cm2，Cry1Ba毒力最低，其次是Cry1Ab，而Cry1Ca毒力最高。青霉素影響幼蟲對(duì)晶體毒素的耐受能力；一次添加高劑量（500μg／cm2）青霉素于飼料中顯著提高幼蟲的耐受能力，以含低劑量（60μg／cm2）青霉素的飼料飼養(yǎng)幼蟲多代也能達(dá)到相似的效果。

蘇云金桿菌； 晶體毒素； 甜菜夜蛾； 青霉素； 毒力

＊ 通信作者 E-mail：liguoqing001234＠yahoo.com.cn

轉(zhuǎn)蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）晶體毒素（Cry toxin）基因的棉花品種在我國(guó)已大面積種植多年。其應(yīng)用提高了棉花的抗病蟲能力、產(chǎn)量、質(zhì)量以及棉農(nóng)的收入，減輕了環(huán)境污染，防止了農(nóng)藥中毒。但近幾年轉(zhuǎn)基因棉花卻受到甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）越來越嚴(yán)重的為害［1］。原因之一是轉(zhuǎn)入棉花品種的Cry毒素基因大都由cry1Ac基因改造而來，其產(chǎn)物對(duì)甜菜夜蛾幼蟲毒力差［2－3］。國(guó)外的研究結(jié)果表明，Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca對(duì)甜菜夜蛾的毒力均顯著高于Cry1Ac，是理想的替代毒素。但由于甜菜夜蛾幼蟲對(duì)Cry毒素的耐受能力常受地理種群的影響［2－3］，因此這3種晶體毒素對(duì)我國(guó)甜菜夜蛾幼蟲的毒力需重新評(píng)估。

此外，晶體毒素對(duì)鱗翅目害蟲的毒力還受幼蟲腸道微生物種類的影響。若殺滅舞毒蛾（Lymantria dispar）、小 紅 蛺 蝶 （Vanessa cardui）、煙 草 天 蛾（Manduca sexta）、菜粉蝶（Pieris rapae）和煙芽夜蛾（Heliothis virescens）幼蟲的中腸細(xì)菌，則其對(duì)Bt制劑或晶體毒素的耐受能力顯著提高［4－5］。但同樣措施卻降低了棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiel-la）［4］和小菜蛾（Plutella xylostella）［6］的耐受能力?？梢?，中腸微生物是否影響幼蟲耐受晶體毒素的能力，不僅隨蟲種而不同，而且還隨試驗(yàn)方法和地理種群而變化。

鑒于此，本文測(cè)定了我國(guó)甜菜夜蛾幼蟲對(duì)Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca的耐受能力以及青霉素處理對(duì)耐受能力的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

甜菜夜蛾幼蟲于2009年秋采自江蘇省南京市東郊小白菜田。于養(yǎng)蟲室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)至今。飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃、相對(duì)濕度70%～80%、光周期L∥D＝14h∥10h（光照時(shí)間為07：00～21：00）。人工飼料配方參考黃春露等［7］。老熟幼蟲在剩余飼料中化蛹后，統(tǒng)一剝蛹，在光學(xué)解剖鏡下根據(jù)生殖孔區(qū)分性別并分別保存于培養(yǎng)皿中。成蟲羽化后，約20對(duì)雌雄蛾放置于養(yǎng)蟲籠內(nèi)，并用醫(yī)用紗布覆蓋籠口，任其交配并產(chǎn)卵。飼以5%蔗糖水且每天定時(shí)更換。每天收集產(chǎn)于紗布上的卵，用于繼續(xù)飼養(yǎng)或試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 晶體毒素和青霉素溶液的配制和稀釋

蘇云金桿菌晶體毒素共3種，即Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca，均為活化毒素，購(gòu)于美國(guó)一龍公司（Envirologix Inc.）。取1mg晶體毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于5mL pH為10的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，終濃度為0.2mg／mL。再進(jìn)一步用pH為7.4的PBS稀釋，形成一系列濃度相差2倍的溶液。

純品青霉素購(gòu)置于Sigma公司。先用丙酮配制成濃度為5mg／mL的母液，再于試驗(yàn)前進(jìn)一步用pH為7.4的PBS稀釋，形成一系列濃度相差2倍的溶液，隨配隨用。

1.2.2 生物測(cè)定

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加1mL剛配好的甜菜夜蛾飼料，振平冷凝。隨后每孔加入溶液200μL，其中晶體蛋白溶液和青霉素溶液各100μL。若只需加入一種待測(cè)物質(zhì)，則以pH為7.4的PBS液補(bǔ)充。對(duì)照加入pH為7.4的PBS液200μL。待加入溶液被飼料吸收，形成均勻藥膜后用于試驗(yàn)。

將2齡初大小一致的試蟲接入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1頭，重復(fù)3次。放置于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼喂6d后檢查結(jié)果。死亡試蟲判斷標(biāo)準(zhǔn)為：1）試蟲用昆蟲針刺激后無(wú)自主反應(yīng)；2）刺激后雖有正常自主反應(yīng)，但體重＜7mg。

1.2.3 加入青霉素累代飼養(yǎng)幼蟲

在人工飼料中加入一定量青霉素溶液，使最終濃度為60μg／cm2。將未孵化卵塊接入，累代飼養(yǎng)試蟲。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用幾率值分析法得到濃度對(duì)數(shù)與死亡率幾率值的回歸線。計(jì)算LC50和95%置信限。不同處理間LC50差異的顯著性根據(jù)其95%置信限是否重疊判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 攝食青霉素影響甜菜夜蛾幼蟲對(duì)晶體毒素的耐受性

甜菜夜蛾幼蟲對(duì)3種晶體毒素的耐受能力不同，對(duì)Cry1Ba最不敏感，LC50最高；其次是Cry1Ab，LC50次高；而對(duì)Cry1Ca最敏感，LC50最低。對(duì)3種晶體毒素LC50的95%置信限不重疊，表明幼蟲對(duì)這3種晶體毒素的耐受能力存在顯著差異（表1）。

單獨(dú)飼喂只含青霉素的飼料時(shí)，濃度從30μg／cm2到500μg／cm2均不引起幼蟲的死亡。而飼料中同時(shí)加入晶體毒素和青霉素后，相對(duì)毒力指數(shù)一般大于1，表明青霉素的攝入增加了甜菜夜蛾幼蟲耐受晶體毒素的能力。耐受能力的提高幅度則與加入青霉素的量相關(guān)。在測(cè)定的劑量范圍內(nèi)，加入量越多，提高幅度越大（表1）。

圖1 累代喂食青霉素對(duì)甜菜夜蛾幼蟲耐受Cry1Ca能力的影響

表1 Bt晶體蛋白單獨(dú)或與青霉素共同混合于人工飼料中對(duì)甜菜夜蛾2齡幼蟲的毒力

2.2 含青霉素飼料累代飼養(yǎng)對(duì)甜菜夜蛾幼蟲耐受能力的影響

以含有青霉素的飼料飼養(yǎng)試蟲1代后，其后代幼蟲對(duì)Cry1Ca的耐受能力略有提高，但根據(jù)置信區(qū)間不重疊的標(biāo)準(zhǔn)判斷，與對(duì)照試蟲差異顯著。以含有青霉素的飼料繼續(xù)累代飼養(yǎng)3代，對(duì)Cry1Ca的耐受能力雖進(jìn)一步增高，但增長(zhǎng)幅度變?。▓D1）。

3 討論

國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，晶體毒素的毒力受幼蟲腸道微生物種類的影響。但這種影響不僅隨蟲種不同，而且隨試驗(yàn)方法和地理種群變化，至今沒有一致結(jié)論。同時(shí)前人的研究方法還存在以下不足：1）清除腸道微生物常采用加入抗生素的方法，且加入量太大，常達(dá)到500 μg／g飼料。這影響了幼蟲正常生理生化過程，間接改變了幼蟲對(duì)毒物的耐受能力［6，8］。2）加入的抗生素由青霉素、慶大霉素、利福霉素和鏈霉素混合而成，不能判斷到底是那些菌影響了幼蟲的耐受能力。

為了彌補(bǔ)前人研究方法的不足，本文測(cè)定了青霉素影響幼蟲耐受能力的劑量效應(yīng)。雖然在試驗(yàn)過程中，青霉素不可避免地發(fā)生了部分降解，但試驗(yàn)結(jié)果還是表明，500μg／cm2和250μg／cm2青霉素顯著提高幼蟲對(duì)3種晶體毒素的耐受能力；當(dāng)濃度進(jìn)一步降低時(shí)，青霉素對(duì)幼蟲耐受晶體毒素的能力影響不大。

可見，抗生素與晶體毒素同時(shí)使用，在抗生素劑量過高時(shí)影響幼蟲正常生理生化，而在劑量過低時(shí)又無(wú)明顯誘導(dǎo)效果。為了克服這一矛盾，本文進(jìn)一步測(cè)定了添加低劑量青霉素于飼料中累代飼養(yǎng)幼蟲對(duì)其耐受能力的影響。結(jié)果表明，幼蟲用含60μg／cm2青霉素的飼料飼養(yǎng)1代，能略微提高其對(duì)Cry1Ca的耐受能力；連續(xù)飼養(yǎng)多代并不進(jìn)一步提高其耐受能力?？梢?，這一方法雖可克服抗生素與晶體毒素同時(shí)使用方法的弊端，但能否應(yīng)用于后續(xù)研究尚需進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。同時(shí)，本文未能證實(shí)幼蟲腸道微生物是否確實(shí)受抗生素的影響，這也待后續(xù)試驗(yàn)證明。

［1］ 鄭霞林，王攀，王小平，等.轉(zhuǎn)基因棉甜菜夜蛾的為害現(xiàn)狀、暴發(fā)成因及防治現(xiàn)狀［J］.植物保護(hù)，2010，36（3）：34-38.

［2］ Hernández-Martínez P，F(xiàn)erréJ，Escriche B.Susceptibility ofSpodoptera exiguato 9toxins fromBacillus thuringiensis［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2008，97：245-250.

［3］ Frankenhuyzen K.Insecticidal activity ofBacillus thuringiensiscrystal proteins［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2009，101：1-16.

［4］ Broderick N A，Robinson C，McMahon M，et al.Contributions of gut bacteria toBacillus thuringiensis-induced mortality vary across a range of Lepidoptera［J］.BMC Biology，2009，7：11.

［5］ Broderick N A，Raffa K F，Handelsman J.Midgut bacteria required forBacillus thuringiensisinsecticidal activity［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103：15196-15199.

［6］ Raymond B，Johnston P R，Wright D J，et al.A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity ofBacillus thuringiensisto diamondback moth larvae［J］.Environmental Microbiology，2009，11：2556-2563.

［7］ 黃春霞，朱麗梅，倪玨萍，等.甜菜夜蛾的飼養(yǎng)方法介紹［J］.昆蟲知識(shí)，2002，39（3）：229-231.

［8］ Johnston P R，Crickmore N.Gut bacteria are not required for the insecticidal activity ofBacillus thuringiensistoward the tobacco hornworm，Manduca sexta［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75：5094-5099.

Penicillin ingestion influences toxic effects of several Cry toxins fromBacillus thuringiensisonSpodoptera exigualarvae

Chen Ruirui1， Cui Jinjie2， Li Guoqing1

（1.Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests of Ministry of Education，College of Plant Protection，Nanjing Agricultural University，Nanjing210095，China； 2.Research Institute of Cotton，Chinese Academy of Agricultural Sciences／State Key Laboratory of Cotton Biology，Anyang455000，China）

Toxicities of Cry1Ab，Cry1Ba and Cry1Ca fromBacillus thuringiensisto the 2nd-instar larvae ofSpodoptera exiguawere evaluated.The LC50values were 0.442 5μg／cm2，0.675 7μg／cm2and 0.150 2μg／cm2，respectively.Cry1Ba was least toxic，followed by Cry1Ab，and Cry1Ca was most toxic.Penicillin affected larval tolerance to the 3Cry toxins.At the concentration of 500μg／cm2，penicillin mixed directly with the toxins could significantly increase larval tolerance.At the concentration of 60μg／cm2，however，penicillin should be first added alone to the diet for the larvae for several generations to obtain similar tolerance.

Bacillus thuringiensis； Cry toxin；Spodoptera exigua； penicillin； toxicity

S 476.11

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.06.021

2011-09-14

2011-10-11

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2008X08011-002，2011ZX08011-002）