鄭超波， 江靜雯， 殷衛(wèi)海 劉建榮

很多蛋白的生物學(xué)活性可以被可逆的翻譯后的修飾來(lái)協(xié)調(diào)［1］。近年來(lái)，蛋白賴氨酸e-氨基的乙酰化在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的一些關(guān)鍵的生物學(xué)功能作用受到廣泛關(guān)注［2，3］。目前研究證實(shí)參與去乙?；鸵阴；{(diào)控的酶分別只有組蛋白脫乙?；?HDACs)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)［2，4］。其中 Sirtuins 是一種以NAD為輔酶的比較特殊的去乙?；?，Sirtuins蛋白共有7種(SIRT1-7)，每種都有1個(gè)由275個(gè)氨基酸組成的催化核心區(qū)域，SIRT2主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，但是在細(xì)胞分裂的G2/M期可以進(jìn)入細(xì)胞核中使得組蛋白H4脫乙?；鶑亩{(diào)控細(xì)胞分裂周期［5，6］。雖然 SIRT2是一種組蛋白脫乙?；?，但其底物也可以是其他的一些蛋白如P53、FOXOs和NF-κB等。在氧化應(yīng)激和炎癥刺激下，SIRT2可以分別通過(guò)對(duì)Foxo3a和NF-KB脫乙?；鶃?lái)減少細(xì)胞在應(yīng)激下引起的損傷［7，8］，并且有研究指出在雙氧水刺激后，AGK-2可以加重PC12細(xì)胞內(nèi)ATP值的下降［9］，炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)ATP值下降是腦缺血再灌注損傷的重要病理過(guò)程，因此SIRT2在腦缺血中可能存在神經(jīng)保護(hù)的作用。在本次實(shí)驗(yàn)中利用缺血再灌注損傷小鼠模型來(lái)觀察缺血前后皮質(zhì)中SIRT2蛋白水平的變化，并探討SIRT2在腦缺血再灌注損傷中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選擇成年健康雄性CD1小鼠86只，體重25～30g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)提供。實(shí)驗(yàn)第1部分將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組15只，缺血再灌注組33只，即缺血60min，再灌注6h 6只，12h 12只，24h 15只;實(shí)驗(yàn)第2部分小鼠隨機(jī)分為DMSO組 6只，AGK-2(2.5mmol/L)組 6只，AGK-2(5mmol/L)組6只;第3部分小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組5只，DMSO組5只，AGK-2(2.5mmol/L)組5只，AGK-2(5mmol/L)組5只。

給藥途徑和方法:參考細(xì)胞中AGK-2給藥的方法［9］術(shù)前給予左側(cè)側(cè)腦室定位注射不同濃度(2.5mmol/L、5.0mmol/L)AGK-25μl，對(duì)照組給予 DMSO 5μl，側(cè)腦室坐標(biāo)參考小鼠解剖圖譜定位于前囟后0.7mm，旁開(kāi) 1.5mm，進(jìn)針2.0mm，給藥后即給予手術(shù)。

1.2 腦缺血再灌注損傷(t-MCAO)模型的制作

1.2.1 栓線的處理 將6-0栓線(Dermalon，0.12mm，美國(guó))的尖頭靠近高溫?zé)破?Bovie，美國(guó))燒成圓頭，切割1.5cm，然后將栓線伸入含有硅橡膠的 PE-10(BD，I.D.0.28mm)管中，包裹長(zhǎng)度約2.0mm，沾有硅橡膠的線拴直徑約為0.25mm，自然晾干。

1.2.2 手術(shù)過(guò)程 手術(shù)參考既往文獻(xiàn)介紹的方法［10］將線栓從頸外動(dòng)脈處逆行插向頸總動(dòng)脈的分叉處，再將線栓轉(zhuǎn)至頸內(nèi)動(dòng)脈腔，動(dòng)作輕緩地將線栓小心經(jīng)顱內(nèi)段頸內(nèi)動(dòng)脈插入至感到輕微阻力，進(jìn)線深度為0.9±0.05cm，用套線將線栓固定在頸外動(dòng)脈殘端，60min后拔出線栓。手術(shù)過(guò)程保持小鼠的體溫在37±0.5℃。將線栓阻塞后血流降低至線栓阻塞前血流的20%以下，60min拔出線栓后血流上升至阻塞前血流的80%以上的小鼠為手術(shù)成功模型做后繼的實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物蘇醒后表現(xiàn)為提尾時(shí)右側(cè)前肢內(nèi)收屈曲、同側(cè)Horner征、爬行時(shí)向右劃圈;站立時(shí)右側(cè)傾倒，凡有上述4項(xiàng)體征者列入研究對(duì)象。假手術(shù)對(duì)照組小鼠僅進(jìn)行頸部血管分離和頸外動(dòng)脈結(jié)扎。

1.3 Western blot法檢測(cè) 處死小鼠后，斷頭取腦，在動(dòng)物顯微鏡下分離缺血側(cè)皮質(zhì)，放入1.5ml的EP管中，隨后加入RIPA，Cocktail，PMSF抽提總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，隨后進(jìn)行電泳。電泳時(shí)用5%濃縮膠，10%的分離膠，電壓首先用50V，待指示條帶越過(guò)濃縮膠后將電壓調(diào)制120V，指示帶到達(dá)分離膠底部時(shí)終止電泳，隨后取膠轉(zhuǎn)膜，半干轉(zhuǎn)13V 20min，用5%的脫脂牛奶常溫封閉1h，TBST×3次每次15min，加入多克隆一抗(SIRT2:兔抗小鼠，1∶300，Santa Cruz;Actin:羊抗小鼠，1∶1000，Santa Cruz)4℃搖晃過(guò)夜，TBST×3次 每次15min，加入二抗(羊抗兔，1∶5000，Beyotime;兔抗羊，1∶5000，Beyotime)常溫下?lián)u晃 1h，TBST ×3 次每次15min，隨后在膜表面加入化學(xué)發(fā)光底物(1∶1混合，Thermo)，1min后在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)中顯影(Bio-rad)。

1.4 RNA 檢測(cè)

1.4.1 組織中RNA提取 處死小鼠后，斷頭取腦，在動(dòng)物顯微鏡下分離缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體，分別放入1.5ml的 EP管中，加 Trizol試劑，每100mg組織對(duì)應(yīng)1ml Trizol混勻，4℃離心(12000r/min×10min)，取上清液加入 200μl氯仿，混勻，4℃離心(12000r/min×15min)，取上清液加入等體積異丙醇，搖勻，室溫靜置10min，4℃離心(12000r/min×10min)，白色沉淀即為mRNA。棄上清，用1ml 75%乙醇洗 mRNA，4℃離心(7500r/min×5min)，棄上清，生物安全柜開(kāi)風(fēng)機(jī)晾干沉淀，每管加20ml的DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水溶解。分光光度計(jì)OD260/280測(cè)總RNA濃度，－70℃凍存。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 引物序列 SIRT2 F:5’-GCCTGGGTTCCCAAAAGGAG-3’ R:5’-GAGCGGAAGTCAGGGATACC-3’;內(nèi)參 GAPDH F:5’-CCTTCATTGACCTCAACTAC-3’R:5’-GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3’。均由上海生工生物工程公司合成。以前面提取的總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物，Quant qRT-PCR(SYBR Green I)Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，嚴(yán)格按說(shuō)明書操作程序執(zhí)行，獲得的反應(yīng)產(chǎn)物(cDNA)置入－20℃冰箱保存，待下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.4.3 Real-time PCR 反應(yīng) 在 200μl的滅菌離心管中加入:(25ml反應(yīng)體系)模板cDNA 0.5μl，上游引物 0.5μl，下游引物 0.5μl，SYBR green supermix 12.5μl，去離子水 11μl。把離心管迅速放入PCR擴(kuò)增儀，按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94℃預(yù)變性 5min;94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，40 個(gè)循環(huán);72℃延伸7min)。

1.5 免疫熒光染色

1.5.1 冰凍切片的制備 麻醉動(dòng)物后斷頭，取腦，將腦組織置于－80℃的異戊烷中冷凍，以O(shè)CT包裹腦組織后用冰凍切片機(jī)(Leica德國(guó))切片，取材部位從距離嗅球2mm開(kāi)始到見(jiàn)到腹側(cè)海馬為止，切片置于－80℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.5.2 SIRT2免疫熒光染色 將冰凍切片從－80℃冰箱取出，在室溫下風(fēng)干30min，用4%的多聚甲醛固定10min，PBS(1×)清洗3次，每次5min，然后加入10%的BSA封閉30min，加入一抗(兔抗小鼠，1∶300，Santa Cruz)，4℃冰箱中放置過(guò)夜，PBS×3次，每次 5min，加入熒光抗體(1∶200，Alex568)，常溫孵育1h，PBS ×3 次，每次 5min，加入DAPI孵育5min，PBS×3 次，每次5min，用防猝滅劑封片液封片，在激光共聚焦顯微鏡下(Leica德國(guó))觀察，獲取圖像(×400)。

1.6 再灌注后24h梗死體積計(jì)算 再灌注后24h，過(guò)量麻醉小鼠致死，取腦，將腦切成2mm的冠狀腦片，共5片。將腦片放入2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中，37℃，孵育20min，放入4%多聚甲醛中;梗死部位顯現(xiàn)白色，而鮮紅色代表未缺血的部位，缺血側(cè)的梗死面積用Image J軟件分析，梗死體積計(jì)算:第一片和最后一片的體積按照?qǐng)A錐體來(lái)算則V=2/3×(S+√S)，中間部分則按梯形體來(lái)算 V=2/3×［(Sn+Sn+1+√(Sn+Sn+1)］，梗死總體積則將兩部分相加。

1.7 再灌注后24h神經(jīng)功能損害評(píng)分 采用CHOPP評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［11］對(duì)神經(jīng)功能損害進(jìn)行評(píng)分。

1.8 MPO和SOD活性測(cè)定 分別按照MPO、SOD活力試劑盒(南京建成)中說(shuō)明書的方法對(duì)缺血側(cè)腦組織中的MPO和SOD活性進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組和I/R組小鼠皮質(zhì)中SIRT2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化 皮質(zhì)中，與對(duì)照組比較，SIRT2 mRNA水平在再灌注后6、12、24h表達(dá)逐漸升高(P＜0.05)，并且在24h升高最為明顯(見(jiàn)圖1);和mRNA的結(jié)果相符，SIRT2的蛋白水平在再灌注后12、24h表達(dá)升高(P＜0.05)(見(jiàn)圖2、圖3)。

2.2 假手術(shù)組和I/R 24h小鼠皮質(zhì)中SIRT2免疫熒光染色結(jié)果 通過(guò)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)對(duì)照組相比，再灌注損傷24h后，可以看到皮質(zhì)區(qū)的SIRT2的表達(dá)上調(diào)(見(jiàn)圖4，I－II);并且在再灌注24h后，皮質(zhì)中的SIRT2和假手術(shù)組一樣也是表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中(見(jiàn)圖4，II)。

2.3 再灌注后24h梗死體積測(cè)定和神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果 AGK-2是一種特異性的SIRT2活性抑制劑［9］，當(dāng)側(cè)腦室注射不同濃度的AGK-2后，發(fā)現(xiàn)AGK-2(5.0mmol/L)組和DMSO對(duì)照組比較梗死體積增大(28.99 ± 3.34mm3，16.48 ± 1.09mm3，P=0.028)，神經(jīng)功能缺損加重(9.43 ±0.53，6 ±0.46，P=0.002);而 AGK-2(2.5mmol/L)和對(duì)照組相比梗死體積(15.31 ±1.21mm3，16.48 ±1.09mm3，P=0.5)和神經(jīng)功能評(píng)分(6.38 ±0.42，6 ±0.46，P=0.58)均無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖5、圖6)。

2.4 假手術(shù)組和再灌注后24h SOD和MPO測(cè)定的結(jié)果 分別利用SOD、MPO試劑盒來(lái)檢測(cè)缺血側(cè)/左側(cè)腦組織中SOD和MPO的活性，得出AGK-2(5.0mmol/L)組和DMSO組相比顯著增加MPO活性(2.72 ±0.50 活力單位/克濕片，0.39 ±0.03 活力單位/克濕片，P=0.019)，減少 SOD 活性(5.29 ±1.04U/mgprot，13.80 ± 1.04U/mgprot，P=0.004);AGK-2(2.5mmol/L)和 DMSO 組比較對(duì) MPO(0.59±0.12 活力單位/克濕片，0.39 ±0.03 活力單位/克濕片，P=0.2)，SOD 活性(13.03 ±2.50U/mgprot，13.80 ± 1.04U/mgprot，P=0.30)影響不大;DMSO對(duì)照組和假手術(shù)組比較 MPO(0.39±0.03活力單位/克濕片，0.15 ±0.03 活力單位/克濕片，P=0.02)和 SOD 活性(13.80 ±1.04U/mgprot，25.01 ±1.16U/mgprot，P=0.002)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)圖7)。

圖1 再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)和假手術(shù)組皮質(zhì)中SIRT2 mRNA表達(dá)水平比較

圖2 假手術(shù)組和再灌注后12、24h皮質(zhì)中的SIRT2蛋白表達(dá)(Western blot)

圖3 再灌注后12、24h皮質(zhì)中和假手術(shù)組SIRT2蛋白表達(dá)水平比較

圖4 對(duì)照組和缺血再灌注后24h皮質(zhì)中SIRT2的表達(dá)

圖5 AGK-2給藥組和DMSO對(duì)照組TTC染色

圖6 AGK-2給藥組和DMSO對(duì)照組再灌注后24h梗死體積和行為學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)圖

圖7 假手術(shù)組、AGK-2組和DMSO組的MPO、SOD活性統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

SIRT2是Sirtuin家族中的一種，表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，Wang等人在細(xì)胞中給予雙氧水(100μmol/L或500μmol/L)刺激24h后 SIRT2的 mRNA水平上調(diào)［7］，并且在心肌細(xì)胞中，給予缺氧再充氧后，隨著缺氧時(shí)間的增加SIRT2 mRNA的表達(dá)也是逐漸增加的［12］，在本次實(shí)驗(yàn)中，缺血再灌注后 6、12、24h，皮質(zhì)中的SIRT2 mRNA水平表達(dá)上調(diào)，并且與mRNA結(jié)果相符，在再灌注后12、24h皮質(zhì)中的SIRT2蛋白水平表達(dá)增高。SIRT2在腦組織中的表達(dá)很豐富，在體內(nèi)和體外研究中都提示SIRT2主要表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞中，也可以在一些神經(jīng)元中表達(dá)［13～15］。幾乎所有的研究都證實(shí)，在有絲分裂后的細(xì)胞中，無(wú)論是少突膠質(zhì)細(xì)胞還是神經(jīng)元SIRT2都只是表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中［14］;同樣在雙氧水刺激后，Wang等人也并沒(méi)有在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)SIRT2的存在［7］，并且Karin等人研究證實(shí)在細(xì)胞給予IL-6刺激后，同樣不會(huì)引起SIRT2往核內(nèi)的轉(zhuǎn)移［8］，在本次實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)和假手術(shù)對(duì)照組相比，腦缺血再灌注后皮質(zhì)中SIRT2沒(méi)有和細(xì)胞核融合。

我們利用SIRT2特異性的活性抑制劑AGK-2，將其定位注射至側(cè)腦室中，可以發(fā)現(xiàn)高濃度的AGK-2(5mmol/L)可以加重缺血再灌注后的神經(jīng)損害作用，提示SIRT2對(duì)于缺血后的腦組織有保護(hù)作用。炎癥和氧化應(yīng)激是參與腦缺血再灌注損傷的重要的兩個(gè)因素，既往研究證實(shí)不論是抑制缺血后腦組織中的炎癥反應(yīng)還是降低腦組織中的氧化應(yīng)激水平都具有神經(jīng)保護(hù)作用［16，17］，因此我們利用 MPO 和SOD試劑盒分別對(duì)給藥組和對(duì)照組腦組織中的炎癥和氧化應(yīng)激水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)高濃度的AGK-2可以加重缺血后腦組織中的炎癥水平，而降低其氧化應(yīng)激水平;但是對(duì)于在缺血后腦組織中AGK-2調(diào)控炎癥和氧化應(yīng)激的機(jī)制目前尚不清楚，但有研究證實(shí)在給予雙氧水刺激的細(xì)胞中，SIRT2可以促進(jìn)FOXO3a的轉(zhuǎn)錄活性，刺激MnSOD的表達(dá)，增加細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激的能力，并且Karin等人研究發(fā)現(xiàn)在炎癥因子的刺激下，細(xì)胞中SIRT2可以使得NF-κB去乙?；?，從而減少其的轉(zhuǎn)錄活性，減少炎癥介質(zhì)如 IL6、MMP9 和 COX-2 的表達(dá)［8］，以上證據(jù)提示SIRT2可能分別是通過(guò)調(diào)控 NF-κB和 FOXO3a影響腦缺血再灌注損傷后的炎癥和氧化應(yīng)激水平，這還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)去證實(shí)。

SIRT2對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)還可能有其他的機(jī)制參與，有研究報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)SIRT2可以去乙?；疨53，使得P53的轉(zhuǎn)錄活性降低從而減少細(xì)胞的凋亡［18］，相反SIRT2的下調(diào)可以導(dǎo)致P53的細(xì)胞內(nèi)聚集而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［19］;在氧化應(yīng)激情況下SIRT2還可以加重細(xì)胞內(nèi)的ATP值的下降［9］，以上提示SIRT2可能也可以通過(guò)調(diào)控凋亡和細(xì)胞內(nèi)的ATP水平對(duì)缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，但還需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。

通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們得出和假手術(shù)組相比，缺血再灌注損傷皮質(zhì)中SIRT2的mRNA和蛋白的表達(dá)增高;并且SIRT2可以通過(guò)降低腦組織中炎癥和氧化應(yīng)激水平來(lái)減輕缺血再灌注引起的腦組織損傷。

［1］ Jensen ON.Interpreting the protein language using proteomics［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7:391 －403.

［2］ Haberland M，Montgomery RL，Olson EN.The many roles of histone deacetylases in development and physiology:implications for disease and therapy［J］.Nat Rev Genet，2009，10:32 －42.

［3］ Polevoda B，Sherman F.The diversity of acetylated proteins［J］.Genome Biol，2002，3(5):reviews0006.

［4］ Yang XJ，Seto E.HATs and HDACs:from structure，function and regulation to novel strategies for therapy and prevention［J］.Oncogene，2007，26:5310 －5318.

［5］ Yang YH，Chen YH，Zhang CY，et al.Cloning and characterization of two mouse genes with homology to the yeast Sir2 gene［J］.Genomics，2009，69:355 －369.

［6］ Vaquero A，Scher MB，Lee DH，et al.SirT2 is a histone deacetylase with preference for histone H4 Lys 16 during mitosis［J］.Genes Dev，2006，20:1256 －1261.

［7］ Wang F，Nguyen M，Qin XF，et al.SIRT2 deacetylates FOXO3a in response to oxidative stress and caloric restriction［J］.Aging cell，2007，6:505 －514.

［8］ Karin MR，Erener S，Waibei S，et al.SIRT2 regulates NF-Kb-dependent gene expression through deacetylation of P65 Lys310［J］.J Cell Sci，2010，123(24):4251 － 4258.

［9］ Nie H，Chen H，Han J.Silencing of sirt2 induces cell death and a decrease in the intracellular ATP level of PC12 cells［J］.Int J physiol Pathophysiol Pharmacol，2011，3(1):65 －70.

［10］ Guo YY，Betz AL.Reperfusion-induced injury to the blood-brain barrier after middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，1994，25:1658 －1664.

［11］ Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］.Stroke，2001，32(4):1005 －1011.

［12］ Edward GL，Christopher JM，Jeorey PG.SIRT2 is a negative regulator of anoxia-reoxygenation tolerance via regulation of 14-3-3 f and BAD in H9c2 cells［J］.FEBSLetters，2008，582:2857 －2862.

［13］ Taylor DM，Maxwell MM，Luthi-Carter R，et al.Biological and potential therapeutic roles of sirtuin deacetylases［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65:4000 －4018.

［14］ Pandithage R，Lilischkis R，Harting K，et al.The regulation of SIRT2 function by cyclin-dependent kinases affects cell motility［J］.J.Cell Biol，2008，180:915 － 929.

［15］ Li W，Zhang B，Tang J，et al.Sirtuin 2，a mammalian homolog of yeast silent information regulator-2 longevity regulator，is an oligodendroglial protein that decelerates cell differentiation through deacetylating alpha-tubulin［J］.J Neurosci，2007，27:2606 －2616.

［16］ Denes A，Thornton P，Rothwell NJ，et al.Inflammation and brain injury:Acute cerebral ischemia，peripheral and central inflammation［J］.Brain Behav Immun，2010，24，708 －723.

［17］ Niizuma K，Endo H，Chan PH.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction as determinants of ischemia neuronal death and survival［J］.J Neurochem.2009，109(suppl 1)，133 －138.

［18］ Jin YH，Kim YJ，Kim DW.SIRT2 interacts with 14-3-3 beta/garmma and down regulates the activity of P53［J］.Biochem BiophysRes Communic，2008，368:690 －695.

［19］ Li Y，Matsumori H，Nakayama Y，et al.SIRT2 down-regulation in Hela can induce P53 accumulation via P38 MAPK activation-dependent P300 decrease evevtually leading to apoptosis［J］.Gene Cells，2011，16(1):34 －45.