魏 歡， 李 玲， 戰(zhàn)麗萍， 張 波， 趙 嘉， 裴 中， 黃如訓

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferators activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)是近年來備受關注的轉錄調控輔助激活因子。其促進線粒體增殖［1］、抗氧化［2］、促進血管內皮細胞增生［3］的作用為缺血性疾病的血管保護提供了新的藥物治療靶點。本次研究旨在探討國家I類新藥丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)在糖氧剝奪 (Oxygen Glucose Deprivation，OGD)模型中，對PGC-1α這種內源性保護因子表達的影響及其可能機制;以尋找 NBP促進血管增生［4］、保護線粒體［5］的具體機制及其關鍵治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與分組 大鼠主動脈內皮細胞(SV40-transformed aortic rat endothelial cell line，SVAREC)，購自上海博邁公司。隨機分為對照組(Control)、單純糖氧剝奪組(OGD)、丁基苯酞預處理+糖氧剝奪組(NBP+OGD)、丁基苯酞預處理+糖氧剝奪+特異性eNOS抑制劑組(NBP+OGD+LNIO)。

1.1.2 主要試劑與儀器 99.9%丁苯酞原液由石家莊制藥集團有限公司饋贈。兔抗大鼠PGC-1α單克隆抗體(Cell Signaling);小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(Multisciences Biotech Co，Ltd);山羊血清封閉液(博士德);FITC標記山羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology);Anti-rabbit IgG-HRP Antibody(R＆D);N5-(1-Imino ethyl)-L-ornithine·HCL，L-NIO(BIOMOL);MTT粉末(廣州博理生物科技公司);一氧化氮合成酶(NOS)測試盒(南京建成科技有限公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);電泳儀、電轉儀、凝膠成像分析系統 (美國BIO-RAD公司);全自動酶標儀(BIO-TEK);缺氧盒、氣壓儀(長沙長錦科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 內皮細胞培養(yǎng) 大鼠主動脈內皮細胞(SVAREC)種于25cm2培養(yǎng)瓶，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)基為RPMI 1640+10%胎牛血清(FBS)。待細胞融合至80%左右，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 糖氧剝奪模型 待種植于培養(yǎng)皿中的細胞生長融合至80% ～90%時，吸出培養(yǎng)基，按不同分組分別加入預先配置好的不同濃度NBP或正常培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中預處理1h。1h后各缺氧組換以缺氧液(缺氧液預先持續(xù)充以95%N+25%CO2混合氣體約15min);立即將培養(yǎng)板/皿置于密封的缺氧盒中，自入氣孔中通入95%N2+5%CO2混合氣體5L/min，約30min后夾閉出入氣孔，將缺氧盒置于37℃細胞培養(yǎng)箱中溫育6h。6h后停止缺氧，將各組培養(yǎng)液換成正常培養(yǎng)基;重新放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.3 內皮細胞損傷程度MTT細胞活性測定處理好的細胞吸出各孔培養(yǎng)基，加入無血清1640液180μl和 MTT(5mg/ml)20μl，置于5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，37℃條件下溫育4h后，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲亞砜，37℃振搖10min?？装逯糜诿笜藘x上，570nm波長測定各孔吸光度值(A570nm)。

1.2.4 內皮細胞eNOS酶活性測定按試劑盒說明進行。

1.2.5 免疫熒光 處理好的細胞用冰凍PBS洗去培養(yǎng)基;加4%多聚甲醛溶液冰上處理20min，以固定蛋白。0.3%Triton X-100處理30min破膜。山羊血清封閉非特異性抗原30min;滴加PBS稀釋的一抗;4℃孵育過夜。避光環(huán)境下滴加PBS稀釋的熒光二抗37℃條件下孵育1h;Hoechst染核。在熒光顯微鏡下拍攝熒光照片。采用美國ImagePro Plus圖像分析系統進行分析。

1.2.6 Western-Blot檢測 細胞種植于直徑60mm的培養(yǎng)皿中，各組處理同前。根據細胞蛋白提取試劑盒(BioVision)方法，提取細胞總蛋白，并測定各組蛋白濃度。取等量樣品進行SDA-PAGE電泳并轉導硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉液室溫搖床封閉1h;加入一抗，4℃搖床孵育過夜;加入HRP標記的抗兔二抗室溫搖床孵育1h;洗膜后加入適量化學發(fā)光劑(0.125ml/cm2)，暗室中用X光片曝光，沖洗，晾干。

1.2.7 圖像分析及統計分析方法 所有結果以均數±標準差±s)。兩樣本的顯著性比較用獨立樣本的t檢驗，采用SPSS13.0 for Windows軟件進行統計分析，以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度NBP對OGD損傷下內皮細胞活性的影響 OGD 6h后，內皮細胞活性下降到44.55±0.423%。NBP預處理1h能很好地保護細胞活性，呈一定的量效關系。從 NBP 0.01～10μmol，細胞活性分別上升至 51.48 ±0.513%、60.60 ±0.803%、71.26±0.596%、69.77 ± 0.826%，P 值均 ＜ 0.05。NBP 10μmol預處理組較 NBP 1.0μmol預處理組相比，保護作用差別不大(P=0.04)，略有下降，因此后續(xù)實驗中均采用NBP 1.0μmol作為用藥治療組(見表1)。

2.2 NBP保護內皮細胞活性與eNOS的關系NBP 1.0μmol預處理組能使單純OGD組細胞活性從44.77%上升至71.39%，具有統計學意義(P＜0.05)。而這種保護作用在合并運用了eNOS特異性抑制劑 N5-(1-Imino ethyl)-L-ornithine·HCL(L-NIO)1.0μmol［6］后消失(47.86%)，與單純OGD組比較無明顯差異(P＞0.05)(見表2)。

2.3 NBP對eNOS酶活性的影響 按照試劑盒說明運用分光光度法檢測內皮細胞eNOS活性，單位用U/ml表示?？梢钥吹絅BP 1.0μmol使正常及OGD條件下的內皮細胞eNOS活性均增高(P＜0.05);而eNOS特異性抑制劑L-NIO在正常及OGD條件下均明顯抑制eNOS活性(P＜0.05);且L-NIO使NBP的保護作用消失(P＜0.05)(見表3)。

2.4 NBP對OGD條件下內皮細胞中PGC-1α表達的影響及其與eNOS的關系 (1)免疫熒光結果從熒光圖片上可以看到，PGC-1α這種核轉錄調控因子主要在細胞核內表達。與正常細胞相比，OGD 6h后細胞內 PGC-1α表達增多(P＜0.05)。NBP 1.0μmol預處理組較單純OGD組，能進一步增高細胞內 PGC-1α的表達(P＜0.05)。而在合并運用eNOS抑制劑L-NIO(1.0μmol)之后 NBP的作用減輕(P ＜0.05)(見圖1);(2)Western-blot結果:從蛋白表達水平可以看到，OGD 6h之后細胞內PGC-1α表達水平較正常對照組明顯升高(P＜0.05);加用NBP(1.0μmol)之后較單純OGD組，能進一步增加PGC-1α的表達，具有統計學意義(P＜0.05)。而這種增高在合并運用eNOS抑制劑L-NIO(1.0μmol)之后作用減輕(P＜0.05)(見圖1)。

表1 不同濃度NBP對OGD條件下內皮細胞活性的影響(MTT比色法) ± s，n=6)

表1 不同濃度NBP對OGD條件下內皮細胞活性的影響(MTT比色法) ± s，n=6)

與正常對照組比較*P＜0.05;與單純OGD組比較#P＜0.05

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表2 NBP對內皮細胞活性的影響及其與eNOS酶活性的關系(MTT比色法) ± s，n=6)

表2 NBP對內皮細胞活性的影響及其與eNOS酶活性的關系(MTT比色法) ± s，n=6)

與正常對照組比較*P＜0.05;與單純OGD組比較#P＜0.05;與OGD+NBP組相比＆P＜0.05

組別 細胞活性對照組NBP 1.0μmpl L-NIO 1.0μmol OGD OGD+NBP OGD+NBP+L-NIO OGD+L-NIO 1.0000 ±0.03900.9741 ±0.02830.9754 ±0.05060.4477 ±0.0565*0.7139 ±0.0234*#0.4786 ±0.0380*＆0.3832 ±0.0542*#

表3 NBP對內皮細胞eNOS酶活性的影響(分光光度法)χ ± s，n=6)

表3 NBP對內皮細胞eNOS酶活性的影響(分光光度法)χ ± s，n=6)

與正常對照組比較*P＜0.05;與單純OGD組比較#P＜0.05;與OGD+NBP組相比＆P＜0.05

組別 eNOS活性(U/ml)對照組NBP 1.0μmol L-NIO 1.0μmol OGD OGD+NBP OGD+L-NIO OGD+NBP+L-NIO 0.0036 ±0.000600.0071 ±0.00035*0.0018 ±0.00023*0.0313 ±0.00015*0.0437 ±0.00013*#0.0232 ±0.00025*#0.0294 ±0.00022*＆

圖1 NBP對OGD情況下內皮細胞中PGC-1α表達的影響其與eNOS的關系

3 討論

丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)又名芹菜甲素(apium graveolens linn)，是從芹菜籽揮發(fā)油中分離得到的有效成分。臨床上已制備成恩必普軟膠囊(活性成分為NBP)在12個國家藥品臨床研究基地完成了多中心開放實驗，推薦作為急性缺血性卒中的早期用藥［7］。目前研究發(fā)現，NBP抗腦缺血的保護作用主要體現在保護線粒體［5］、改善微循環(huán)［8］、抗氧化損傷［9］等。然而 NBP 腦保護的具體機制和藥物作用靶點仍需進一步探討。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1(peroxisome proliferators activated receptor-γcoactivator-1，PGC-1)是近年來備受關注的轉錄調控輔助激活因子［1］。它在血管內皮細胞上也有表達;能上調內皮細胞抗氧化相關基因［2］、抑制線粒體活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生、增強內皮細胞抗氧化損傷能力［10］。最新 Zoltan［3］等的研究還發(fā)現，缺氧條件下PGC-1α能通過輔助激活雌激素相關受體(oestrogen-related receptor-a，ERR-α)啟動血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因的表達，與傳統的缺氧誘導因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)路徑不相關。因此運動和各種刺激下主要用于調控線粒體功能的PGC-1α也參與調控了新的血管增生的路徑;從而為缺血組織供應氧氣和營養(yǎng)物質。可以說PGC-1α的相關研究為缺血性疾病的治療提供了新的靶點。

因此本課題研究的目的旨在探討NBP發(fā)揮細胞保護作用的靶點與同樣具有保護線粒體、促進內皮細胞增生的因子PGC-1α之間的相關性。近年來，在多種細胞類型的實驗中均發(fā)現，一氧化氮(Nitrite Oxygen，NO)能增加PGC-1α的表達、促進線粒體的增生［11～13］。國內有學者觀察原代培養(yǎng)的胎鼠皮質神經細胞外液的NO水平，發(fā)現NBP能使低糖低氧條件下皮質神經細胞外液NO水平明顯升高［14］。這就提示我們NBP通過影響血管內皮細胞中NOS及NO水平可能是其保護內皮細胞、調控PGC-1α的途徑之一。

通過實驗我們發(fā)現，NBP 1.0μmol對OGD損傷下的血管內皮細胞有很好的保護作用，能使細胞活性上升約26.7%。繼續(xù)增加NBP濃度并未使保護作用進一步增加，考慮是因為藥物作用靶點已達到飽和所致;過多地增加藥物濃度，可能會產生細胞毒副作用。既往研究發(fā)現，內源性eNOS活性在缺氧發(fā)生的早期階段(2～6h)表達增高［15］。本實驗OGD 6h后eNOS活性增高;NBP 1.0μmol預處理1h組能進一步增高eNOS活性，并促進PGC-1α的表達;而特異性的eNOS抑制劑則使PGC-1α的表達下降。說明在OGD條件下eNOS活性的增高促進了PGC-1α的表達，參與了缺血缺氧早期內皮細胞保護、促進血管增生的過程。同時也證明了NBP保護內皮細胞、促血管增生現象部分是通過保護eNOS酶活性、上調PGC-1α而實現的。

因此，本實驗在離體細胞模型上探明了缺氧條件下獨立于HIF的另外一個促血管增生的因子PGC-1α在OGD條件下的表達情況;并證明了NBP在OGD條件下對內皮細胞中PGC-1α的上調作用。首次在細胞模型上證明了NBP促內皮細胞增生的作用部分是通過保護eNOS酶活性、上調PGC-1α而實現的。然而NBP是如何調控eNOS酶活性，eNOS-NO、PGC-1α、HIF-1α三者之間的調控關系如何;仍需繼續(xù)探討。下一步可采用siRNA干擾的方法敲除內皮細胞中PGC-1α，HIF-1α等;從而更深層次地探討NBP發(fā)揮血管保護作用的靶點所在。

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