劉 昊， 王海濤， 徐愛軍， 李世英， 張晉霞， 張 蕊

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后引起的抑郁癥狀，是腦血管疾病常見并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為興趣減退、易激惹、思維遲緩、食欲減退、悲觀絕望，甚至出現(xiàn)自殺企圖和行為等，嚴重影響患者神經(jīng)功能康復和生存質(zhì)量，增加患者死亡率。但PSD發(fā)病機制尚不明確。杏仁核涉及了抑郁行為、情緒或心境改變的過程［1］，在抑郁癥的病理機制中發(fā)揮重要作用［2］。研究表明，PSD患者存在海馬及杏仁核容積異?？s小［3］。影像學研究結(jié)果也表明抑郁患者杏仁核容積明顯小于對照組［4］。這提示在PSD發(fā)病過程中杏仁核部位存在細胞的異常死亡和丟失。凋亡是細胞程序性死亡方式之一，能導致細胞死亡和數(shù)量減少。在卒中后抑郁癥發(fā)病中杏仁核神經(jīng)元是否存在異常凋亡目前尚未見相關(guān)報道。本實驗建立大鼠PSD模型，檢測杏仁核中是否存在神經(jīng)元凋亡，為揭示卒中后抑郁癥發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只，體重230～250g(河北聯(lián)合大學實驗動物中心提供)。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，飼養(yǎng)條件:22℃ ～25℃、晝夜節(jié)律(12/12h)、自由飲水攝食。

1.1.2 主要試劑 原位細胞凋亡檢測試劑盒(Roch公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及PSD模型建立 隨機將大鼠分為模型組和對照組，每組15只。采用復合造模法制備PSD大鼠模型，即先采用栓線法使大鼠大腦右側(cè)中動脈閉塞(MCAO)，制備大鼠卒中模型。術(shù)后單籠孤養(yǎng)?；謴惋曫B(yǎng)7d后，給予慢性不可預(yù)見的溫和應(yīng)激28d建立 PSD模型。應(yīng)激包括禁食(24h)、禁水(24h)、高溫環(huán)境(45℃)5min、晝夜顛倒24h、水平振蕩30min、冰水游泳(4℃)、夾尾1min等7種。每天隨機選取一種應(yīng)激，相同應(yīng)激不連續(xù)出現(xiàn)，每種應(yīng)激出現(xiàn)4次。對照組除每天抓取1次外，不做其他處理。測量兩組大鼠在慢性應(yīng)激的第1、8、15、22、29 天的體重情況。

1.2.2 行為學實驗 采用以下方法對大鼠進行行為學檢測。(1)糖水實驗:兩組大鼠在慢性應(yīng)激的第1、8、15、22、29 天，每隔 1w 進行禁水 24h，第2天進行糖水消耗實驗，即測定禁水24h后第1小時內(nèi)動物飲用1%蔗糖溶液的量。計算獲得相對糖水消耗量(糖水消耗/體重×100g)，取3次測試平均值作為糖水測試基礎(chǔ)值。(2)開場(open field test，OFT)測試:敞箱自制，長寬高分別為100cm、100cm、60cm，底部劃分為25個20cm×20cm方格。應(yīng)激結(jié)束后進行測試，每次將一只大鼠放入敞箱中心方格內(nèi)，開始計時并攝像記錄大鼠5min的自由活動情況。測試指標包括大鼠的水平運動行為(穿越的方格數(shù)目)和垂直運動行為(動物雙側(cè)前肢離開底面站立的次數(shù))。(3)Morris水迷宮實驗:應(yīng)激結(jié)束后次日開始利用Morris水迷宮測試其空間記憶成績。連續(xù)測試3d，每天5個循環(huán)，記錄其在60s內(nèi)尋找平臺的時間，即逃避潛伏期(EL)。取3d的測試成績計為動物的空間記憶成績。

1.2.3 TUNEL檢測杏仁核神經(jīng)元凋亡 兩組大鼠各取5只處死，快速取出腦組織，常規(guī)石蠟包埋，5μm切片。按照檢測試劑盒說明書進行TUNEL法原位末端標記DNA片段檢測杏仁核神經(jīng)元凋亡。主要步驟:組織切片常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，蛋白酶K消化，TdT反應(yīng)液、anti-fluorescein antibody工作液37℃各作用1h，DAB顯色，蘇木素復染。不含TdT反應(yīng)液的為陰性對照。每張玻片分別隨機取5個高倍鏡視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算陽性細胞率，陽性細胞率(%)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測杏仁核神經(jīng)元凋亡率(%) 兩組大鼠各取5只，麻醉后斷頭取腦。根據(jù)圖譜，在立體顯微鏡下分離右側(cè)杏仁核，置于預(yù)冷的PBS中，剪成小碎塊，0.25%胰酶37℃恒溫消化30min。200目篩網(wǎng)過濾后800r/min 4℃離心8min，棄上清，加入PBS液3ml懸浮細胞。重復操作一次，調(diào)整細胞濃度為5×105/ml ～1×106/ml。取1ml細胞懸液，1000r/min 4℃離心10min，棄上清，加入1ml預(yù)冷PBS，輕輕振蕩使細胞懸浮。重復操作3次。將細胞重懸于200μl Binding Buffer液中，加入10μl Annexin V-FITC 和5μl Propidium Iodide，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min。加入300μl Binding Buffer液，上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 體重增長 兩組大鼠體重變化(見圖1)。經(jīng)過2w時間的應(yīng)激后，模型組大鼠體重趨勢明顯減緩。

2.2 行為學結(jié)果

2.2.1 糖水偏好實驗結(jié)果 兩組大鼠相對糖水消耗量(見表1)。22d開始，模型組大鼠相對糖水消耗量較對照組顯著減少(P＜0.05)。

2.2.2 曠場實驗結(jié)果 兩組大鼠在曠場箱內(nèi)主要在箱壁區(qū)域活動，其運動符合嚙齒類動物的趨觸性自然屬性，即嚙齒類動物趨向于沿壁活動。兩組大鼠5min內(nèi)中央格停留時間、穿行格數(shù)、直立次數(shù)、修飾行為結(jié)果(見表2)?？梢娔Ｐ徒M大鼠中央格停留時間和直立次數(shù)顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

2.2.3 水迷宮結(jié)果 對照組與模型組大鼠平均逃避潛伏期分別為 5.632 ±1.065s、20.762 ±3.236s，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.3 TUNEL染色結(jié)果 光鏡下可見凋亡神經(jīng)元胞核深染為棕黃色，非凋亡神經(jīng)元胞核則呈藍色。對照組可見少量TUNEL陽性細胞，模型組TUNEL陽性細胞明顯增多。分析結(jié)果(見表3)，對照組和模型組凋亡神經(jīng)元陽性率分別為3.91% ±0.49%和25.04% ±6.32%，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

2.4 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果 可見對照組和模型組神經(jīng)元凋亡率分別為 3.50% ±0.5%和18.75% ±2.95%，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，結(jié)果(見表3)。

圖1 兩組大鼠體重變化，與對照組比較*P＜0.05，＊＊ P＜0.01

表1 兩組大鼠糖水消耗量變化 ± s，ml)

表1 兩組大鼠糖水消耗量變化 ± s，ml)

與對照組比較*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

對照組模型組13.3 ±2.113.4 ±1.612.9 ±2.114.5 ±1.713.8 ±3.013.2 ±1.714.1 ±2.312.0 ±1.615.9 ±2.711.5 ±1.1*19.1 ±3.310.6 ±2.1＊＊

表2 兩組大鼠曠場實驗結(jié)果(n=5，±s)

表2 兩組大鼠曠場實驗結(jié)果(n=5，±s)

與對照組比較*P＜0.05

對照組模型組13.75 ±0.575.00 ±0.82*39.50 ±4.2030.75 ±3.956.00 ±0.82*1.75 ±0.9612.25 ±2.069.75 ±1.26

表3 兩組大鼠TUNEL染色和流式細胞術(shù)結(jié)果(n=5±s)

表3 兩組大鼠TUNEL染色和流式細胞術(shù)結(jié)果(n=5±s)

對照組模型組3.91 ±0.4925.04 ±6.32＊＊3.50 ±0.5218.75 ±2.95＊＊

3 討論

PSD是腦卒中后引起的抑郁癥狀，是腦血管疾病常見并發(fā)癥。本研究中采用復合造模法制備PSD大鼠模型，即采用大腦中動脈線栓再灌注法制備局灶性腦缺血大鼠模型(模擬人類PSD發(fā)生的“原發(fā)性內(nèi)源性機制”學說)。卒中大鼠神經(jīng)缺損基本恢復后，相繼給予孤養(yǎng)和慢性不可預(yù)見性應(yīng)激處理，現(xiàn)實地模擬卒中患者受到的生活應(yīng)激事件和困難(模擬人類PSD發(fā)生的“反應(yīng)性機制”學說)，從而誘導或加重PSD的發(fā)生。實驗結(jié)果表明，在造模過程中，模型動物處于明顯抑郁狀態(tài)，可見精神萎靡，毛色晦滯，體重減輕，各種活動減少，在規(guī)定的時間內(nèi)水平活動和垂直活動次數(shù)減少，糖水消耗量降低，逃避潛伏期增加。提示大鼠可以模擬快感缺失、精神運動抑制、記憶力減退等臨床抑郁癥狀，具備較好的癥狀正確性，是一種較好的PSD動物模型。

抑郁癥并非完全是功能性的精神障礙，患者存在腦形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。抑郁癥的異常部位可涉及部分額葉和顳葉以及與其相聯(lián)系的紋狀體、皮質(zhì)和丘腦。作為邊緣系統(tǒng)的杏仁核與海馬更是共同參與了情感行為的形成、自主活動、內(nèi)分泌整合等過程，在抑郁癥的發(fā)病機制中起著重要作用。PSD是腦血管疾病的主要并發(fā)癥，PSD較抑郁癥更存在器質(zhì)性病變的基礎(chǔ)。對抑郁患者杏仁核的研究，結(jié)果均表明杏仁核存在神經(jīng)元數(shù)量和體積明顯縮小［3，4］，提示杏仁核中存在異常的細胞死亡和丟失。凋亡(apoptosis)是一種程序性死亡方式，以細胞內(nèi)caspase激活為起點，以細胞核濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段、細胞縮小、最終形成凋亡小體而不引起周圍細胞的溶解等形態(tài)變化為特征。本實驗結(jié)果顯示，卒中后抑郁大鼠杏仁核神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。抑郁患者尸檢資料也表明，抑郁患者杏仁核中膠質(zhì)細胞數(shù)目及密度明顯減少［5］?？梢姡尤屎瞬课患毎蛲隹赡芘c杏仁核體積異常有關(guān)。細胞凋亡是由基因控制的細胞程序性死亡過程，是機體生長發(fā)育、細胞分化、生理及病理性死亡的重要機制。細胞凋亡的調(diào)控主要有3條途徑:線粒體途徑、死亡受體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑［6，7］。不同的死亡信號通過不同的途徑誘導細胞凋亡。PSD中杏仁核細胞凋亡的機制有待進一步深入開展。

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