樊紅彬， 劉 君， 董瑞國

腦水腫是缺血性腦血管病的一個重要病理過程，嚴重影響著預(yù)后，對腦水腫的形成機制及防治方法的研究具有重要意義。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一組與水通透有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，是影響水跨膜轉(zhuǎn)運和細胞內(nèi)外環(huán)境平衡調(diào)節(jié)的主要膜蛋白。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，AQP4主要在星形膠質(zhì)細胞表達，AQP4被認為參與了腦水腫的發(fā)病機制［1］。

動物實驗表明，亞低溫(32℃ ～35℃)對腦缺血具有保護作用，其作用機制可能包括降低腦組織氧耗量、保護血腦屏障、減輕腦水腫、抑制內(nèi)源性毒性產(chǎn)物對腦細胞的損害作用、減少鈣離子內(nèi)流、改變腦缺血后各種酶的活性、減輕缺血性神經(jīng)元損傷、調(diào)節(jié)損傷后鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶的活性、抑制神經(jīng)元凋亡、抑制腦損傷缺血缺氧后的炎性反應(yīng)等［2，3］。

本研究選擇測定AS在缺血再灌注及亞低溫干預(yù)時AQP4表達的改變，從離體角度研究亞低溫對缺氧/復(fù)氧星形膠質(zhì)細胞AQP4表達的影響，進一步從分子水平探明亞低溫減輕缺氧性腦水腫的可能機制，為臨床治療腦水腫提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 新生24h內(nèi)SD大鼠(徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，H-DMEM培養(yǎng)基、LDMEM 培養(yǎng)基(Hyclone，USA)，胎牛血清(Gbico，USA)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)小鼠抗大鼠多克隆抗體(Sigma，USA)，兔來源 AQP4多克隆抗體(一抗)(Santa Cruz，USA)，羊抗小鼠、山羊抗兔二步法免疫組化試劑盒(二抗)(北京中山公司)，即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)和鑒定 參照文獻［4，5］創(chuàng)立的方法并加以改進。新生24h內(nèi)的SD大鼠，75%乙醇消毒，斷頭取腦，于冰冷的 D-hanks液中剝除腦膜和血管;D-hanks液沖洗兩遍后用彎眼科鑷撕去蛛網(wǎng)膜及軟腦膜。在兩側(cè)大腦無血管區(qū)夾取少許皮質(zhì)組織，用眼科剪剪碎腦組織成1mm3大小。將混有腦組織碎塊的基本培養(yǎng)液(100%H-DMEM)吸入到5ml離心管內(nèi)，反復(fù)輕柔吹打制成細胞懸液，加入適量0.25%胰蛋白酶充分混勻后置37℃恒溫水浴箱內(nèi)消化20min，中間搖晃1次;之后用完全培養(yǎng)液(20%小牛血清，80%HDMEM)終止消化;再經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液于1500r/min離心10min，棄上清液后加入適量的完全培養(yǎng)液并吹打成單細胞懸液。將此細胞懸液接種于裝有完全培養(yǎng)液的玻璃培養(yǎng)瓶中，置37℃，體積分數(shù)為5%CO2的飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。差速貼壁2h后(去除成纖維細胞)，將未貼壁細胞懸液進行鏡下細胞計數(shù)(去除成纖維細胞)。調(diào)整細胞密度為5×105/cm2后接種鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，在倒置相差顯微鏡下對細胞進行觀察，每隔3d換液1次。

原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)過7～10d的生長，細胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底時，表明細胞生長已經(jīng)進入平臺期。此時進行第1次傳代，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)液，用基本培養(yǎng)液輕洗兩次，用0.25%的胰蛋白酶消化，在相差顯微鏡下觀察，當細胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮、間隙擴大后即刻加入完全培養(yǎng)液終止消化，消化時間約2～5min。用吸管輕輕吹打制成細胞懸液，參照原代培養(yǎng)的步驟，繼續(xù)將細胞懸液離心、重懸，調(diào)整細胞密度為1×105/cm2再次接種，每天在倒置相差顯微鏡下觀察，并根據(jù)細胞的生長情況及液體顏色換液，大約每3～5d，進行下一次傳代(方法及步驟同第1次傳代)。

在細胞傳至第3代后，將其接種于直徑為3cm的一次性無菌培養(yǎng)皿中(底部預(yù)先放置浸潤過多聚賴氨酸的載玻片)，繼續(xù)培養(yǎng)3～5d。待細胞生長至蓋玻片面積的80%以上時，行星形膠質(zhì)細胞鑒定及相關(guān)實驗。

星形膠質(zhì)細胞鑒定:用免疫細胞化學(xué)方法［6］對星形膠質(zhì)細胞進行純度鑒定。取出細胞行常規(guī)固定、過氧化物酶阻斷及血清封閉，加入一抗(1∶1000 GFAP 多克隆抗體)，4℃過夜，0.01mol/L PBS漂洗后，加入生物素標記的二抗(羊抗小鼠1∶200)，37℃孵育30min，PBS漂洗后滴加酶偶合物(SABC)37℃30min，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢。本實驗培養(yǎng)的細胞中95%以上為反應(yīng)陽性的星形膠質(zhì)細胞，符合實驗要求。

1.2.2 實驗分組及常溫和亞低溫條件下缺氧/復(fù)氧模型的建立 實驗分3組:對照組(C組，n=5×7)、常溫缺氧/復(fù)氧組(H 組，n=5×7)及亞低溫缺氧/復(fù)氧組(M組，n=5×7)，其中H組觀察時間點分別為缺氧后4h(H4/R0)、缺氧后8h(H8/R0)、復(fù)氧后 4h、6h、8h、10h 和 12h(H8/R4、H8/R6、H8/R8、H8/R10和H8/R12);M組觀察時間點與H組相同。

按文獻［7，8］方法制作細胞缺氧/復(fù)氧模型。將培養(yǎng)液換為預(yù)先通以缺氧混合氣體(95%N2+5%CO2)30min的無血清L-DMEM培養(yǎng)基，置37℃的缺氧密閉室內(nèi)，繼續(xù)通以缺氧混合氣體，30min后封閉，于37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)，此時開始計算缺氧損傷時間，缺氧8h后再給予完全培養(yǎng)液，放回正常培養(yǎng)箱內(nèi)，開始計算復(fù)氧時間，于缺氧4h和8h及復(fù)氧后4h、6h、8h、10h和12h測定相關(guān)指標。亞低溫組在開始缺氧計時至復(fù)氧結(jié)束的培養(yǎng)溫度為32℃，其余過程同常溫缺氧/復(fù)氧組。對照組在完全培養(yǎng)液、37℃、5%CO2、飽和濕度條件下置普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

細胞存活能力的鑒定:0.4%臺盼藍溶液直接滴于蓋玻片，3min后于×10倍鏡下選取中央視野及上下左右各一個相鄰視野進行細胞計數(shù)，計數(shù)著藍色的細胞數(shù)量及細胞總數(shù)(著藍色為死亡細胞，不著色為活細胞)，計算平均每100個細胞中著藍色的細胞數(shù)［9］。

1.2.3 免疫細胞化學(xué)檢測AQP4的表達 采用免疫細胞化學(xué)染色方法［6］，檢測AQP4表達。取出細胞進行常規(guī)固定、過氧化物酶阻斷及山羊血清封閉;加入一抗(濃度為1∶200)37℃孵育1h后，置4℃過夜;0.01mol/L PBS漂洗后，加入生物素標記的山羊抗兔二抗37℃孵育15min，PBS漂洗后在辣根過氧化物酶37℃下孵育15min，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢。

免疫細胞化學(xué)的半定量方法:顯微鏡下(×40)選取中央視野及上下左右各一個相鄰視野進行細胞計數(shù)，計數(shù)AQP4陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算平均每100個細胞中的AQP4陽性細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各時間點細胞形態(tài)學(xué)觀察 常溫組缺氧4h組細胞形態(tài)變化不明顯，個別細胞變圓、腫脹;缺氧8h組部分細胞出現(xiàn)邊緣皺縮。復(fù)氧后隨著時間的延長細胞變化逐漸明顯，表現(xiàn)為細胞腫脹、變圓，突起增粗縮短，細胞間連接斷裂，有的細胞呈纖維樣改變，輪廓不清，甚至細胞脫落成懸浮狀;大多數(shù)細胞出現(xiàn)分離現(xiàn)象(見圖1)。亞低溫組在缺氧及復(fù)氧時，大部分細胞輪廓較清晰，胞周光暈明顯，突起尚存，僅有少數(shù)細胞出現(xiàn)分離現(xiàn)象(見圖1)。

2.2 星形膠質(zhì)細胞存活能力的比較 與對照組比較，常溫組缺氧4h及8h組細胞死亡數(shù)即有所增多(P＜0.05);隨著缺氧及復(fù)氧時間的延長，細胞死亡數(shù)亦逐漸增多(P＜0.01);至復(fù)氧后12h(H8/R12)，細胞死亡數(shù)甚至達到對照組的10余倍(見表1)。亞低溫組死亡細胞數(shù)表現(xiàn)出同樣的趨勢，缺氧4h及8h時，亞低溫組死亡細胞數(shù)與常溫組比較無明顯差異，從復(fù)氧4h開始，亞低溫組死亡細胞數(shù)明顯少于常溫組(P＜0.05)(見表1)。

2.3 AQP4免疫細胞化學(xué)結(jié)果 AQP4蛋白在星形膠質(zhì)細胞的胞漿及胞膜都有陽性表達。與對照組比較，隨著時間的延長，常溫組AQP4蛋白表達逐漸減弱，陽性細胞數(shù)減少(P＜0.05)，這種趨勢延續(xù)至復(fù)氧后4h，復(fù)氧后6h AQP4蛋白表達雖然仍低于對照組，但其表達開始逐漸增強，陽性細胞數(shù)增加(見表2，見圖2、圖3);復(fù)氧后10h及12h時，其陽性細胞數(shù)甚至明顯高于對照組(P＜0.05)(見表2，圖4)。與對照組比較，亞低溫組AQP4蛋白表達的變化趨勢與常溫組基本相同。與常溫組比較，亞低溫組AQP4蛋白表達自缺氧4h至復(fù)氧8h均較弱，陽性細胞數(shù)少于常溫組(P＜0.05)(見表2，見圖2、圖3);復(fù)氧10h及12h，兩組AQP4蛋白表達水平基本持平(見表2，圖4)。

表1 缺氧/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞死亡數(shù)比較 ± s，n=5)

表1 缺氧/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞死亡數(shù)比較 ± s，n=5)

與對照組比較*P ＜0.05，#P ＜0.01;與常溫組比較 △P ＜0.05

表2 缺氧/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞AQP4染色陽性表達比較± s，n=5)

表2 缺氧/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細胞AQP4染色陽性表達比較± s，n=5)

與對照組比較*P＜0.05;與常溫組比較#P＜0.05

3 討論

星形膠質(zhì)細胞(astrocytes，AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)數(shù)量最多的細胞，它對腦水腫的形成和發(fā)展有重要影響。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一組與水通透有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，它是一種雙向水轉(zhuǎn)運通道，不僅是水進入腦組織的主要通路，也是水排出腦組織的主要通路，對腦內(nèi)多余水分的清除起重要作用［10］。AQP4 主要分布在 AS 上［11］，且可能是 AS胞膜的組成部分［12］，AS可能通過AQP4的參與調(diào)節(jié)腦組織水分的平衡。

研究表明，各種原因引起的腦水腫，包括腦梗死、腦出血、腦部腫瘤、顱腦外傷等，AQP4的表達均出現(xiàn)改變，且與腦水腫密切相關(guān)。然而，在缺血性腦損傷中AQP4的表達變化規(guī)律至今并不明確。Taniguchi等［1］研究了大鼠大腦中動脈永久性栓塞后AQP4 mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)在栓塞周圍皮質(zhì)，AQP4 mRNA的表達水平隨著缺血時間的延長而增高，至栓塞后第7天仍處于較高水平，這與用MRI監(jiān)測腦水腫的變化是一致的，而在梗死中心區(qū)則一直無表達。Aoki等［13］使用雙標免疫組化法測定 AQP4的細胞定位和與缺血灶的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，人大腦梗死時AQP4的表達上升，且缺血灶外周AQP4的免疫反應(yīng)性強于中心。在另外的一些相關(guān)報道中則出現(xiàn)了不同的結(jié)論;Yamamoto［14］等報道在缺氧的情況下，AQP4 mRNA在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞上的表達降低，復(fù)氧后，AQP4 回到基礎(chǔ)水平;Sato 及 Karl［15，16］等的研究也提示缺血性腦損傷后AQP4 mRNA的表達呈下降趨勢。本研究中，常溫下缺氧階段，AQP4蛋白的表達水平呈下降趨勢，隨著復(fù)氧過程的進行，其表達逐步增高，在復(fù)氧后期，其表達水平甚至超過了對照組。出現(xiàn)這種改變的原因可能是多方面的，首先是低氧的調(diào)節(jié)作用:AQP4基因啟動子區(qū)域有低氧誘導(dǎo)因子結(jié)合基序，從低氧到常氧的轉(zhuǎn)變可誘導(dǎo)AQP4的轉(zhuǎn)錄。在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中，低氧可下調(diào)AQP4 mRNA及蛋白的表達［17］，重新給氧又可使AQP4水平恢復(fù)。其次，缺氧性損傷可導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，直接引起AQP4表達障礙。在缺氧性改變中，AQP4的表達水平的改變只是其功能調(diào)節(jié)的一個方面，有研究表明，AQP4可通過可逆性蛋白磷酸化調(diào)節(jié)其水通透性。分子序列分析提示AQP4有幾個可能的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)磷酸化位點［18］。PKC 及PKA活化可分別下調(diào)或上調(diào)AQP4的水通透性［19，20］。AQP4 的第 111 位絲氨酸殘基是 CaMKⅡ磷酸化可能位點，在星形膠質(zhì)細胞通過CaMKⅡ磷酸化，可引起AQP4滲透性增加［21］。因此，雖然缺氧導(dǎo)致了AQP4的表達有所降低，但同時PKA及CaMKⅡ的活化調(diào)節(jié)卻可能使AQP4的功能增強，加之復(fù)氧后AQP4表達水平的不斷上調(diào)，其最終結(jié)果是導(dǎo)致AQP4水的通透性不斷增加，出現(xiàn)細胞水腫、死亡等缺氧性損傷，這與本實驗的觀察結(jié)果相一致。Busto等［22］在1987年首次提出了全身亞低溫(32℃～35℃)治療具有保護腦功能的觀點，有資料表明，亞低溫治療具有多種腦保護效應(yīng)，其中最重要的一點是亞低溫能抑制機體內(nèi)源性有害因子(如興奮性氨基酸、神經(jīng)肽、自由基及單胺類物質(zhì)等)的生成與釋放［2，3］，從而阻斷了腦損傷后內(nèi)源性有害因子所產(chǎn)生的一系列級聯(lián)反應(yīng)。本試驗中觀察到，亞低溫條件下的缺氧性改變導(dǎo)致了AQP4的蛋白表達水平的降低，與此相對應(yīng)的是細胞損傷程度的減輕?？梢哉J為，改變水通道功能可能是亞低溫的神經(jīng)保護機制之一。一方面，亞低溫降低了缺氧階段AQP4的蛋白表達水平;另一方面，由于亞低溫可以有效地減少興奮性氨基酸的釋放及鈣離子內(nèi)流，從而降低CaMKⅡ的活性，間接地下調(diào)了AQP4的通透性。當然后一種假設(shè)還需要進一步的實驗證實。

結(jié)合本實驗結(jié)果，可以設(shè)想如果將亞低溫及AQP4調(diào)節(jié)劑聯(lián)合應(yīng)用就可能有效地控制腦水腫，明顯降低缺血性腦血管病的致殘率與致死率，這可能會成為腦水腫治療領(lǐng)域的新突破。

圖1 A:對照組;B:復(fù)氧10h后，常溫缺氧/復(fù)氧組細胞腫脹、輪廓模糊，出現(xiàn)纖維樣改變

圖2 A:對照組;B:缺氧8h后，常溫缺氧/復(fù)氧組AQP4表達較對照組減弱

圖3 A:對照組;B:復(fù)氧6h后，常溫缺氧/復(fù)氧組AQP4表達較對照組減弱

圖4 A:對照組;B:復(fù)氧12h后，常溫缺氧/復(fù)氧組AQP4表達較對照組增強

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