趙 勇，張 海，趙善民，伍 靜，毛峰峰，郭曉雅，張彩勤，師長宏

2.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科；西安 710032

全球目前約1/3人口處于結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium，tuberculosis，MTB）持續(xù)感染狀態(tài)，5%～10%感染者有可能最終發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核?。╰uberculosis，TB），并成為傳播 MTB的重要傳染源。恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis，Ms）是一種生長快、轉(zhuǎn)化效率高的非致病菌和強(qiáng)的細(xì)胞免疫佐劑，其表達(dá)的外源蛋白可達(dá)MTB的5～10倍，單位時(shí)間內(nèi)分泌的蛋白產(chǎn)量可比MTB增加50～100倍，且對(duì)人、小鼠和豚鼠均不致病，因此可代替卡介苗（BCG）而被發(fā)展成疫苗載體［1］。

我們將MTB的肝素結(jié)合血凝素蛋白（Heparin Binding Hemagglutinin，HBHA）基因和人白細(xì)胞介素（interleukin，IL）12基因融合，構(gòu)建成能攜帶外源基因并介導(dǎo)其在Ms宿主分泌表達(dá)的重組Ms，并對(duì)其蛋白的表達(dá)和表達(dá)的穩(wěn)定性水平進(jìn)行了測(cè)定。以期獲得一種用于MTB治療的候選疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料 大 腸 桿 菌 DH5α、結(jié) 核 分 枝 桿 菌H37Rv、恥垢分枝桿菌（Ms）以及穿梭質(zhì)粒pSMT3由本實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體p MD18T、Ex Taq DNA聚合酶、T4鏈接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、SalI、SphI、Hind III以及DL2000、異丙基硫代－β－D半乳糖苷（IPTG）均購自大連 Ta KaRa公司；HBHA m Ab為本實(shí)驗(yàn)室篩選，hIL12 p Ab購自美國SANTA公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗人IgG購自博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HBHA及hIL12基因的引物設(shè)計(jì) 參考GenBank發(fā)表的HBHA及hIL12基因序列設(shè)計(jì)引物，見表1。由北京奧科生物有限公司合成。HBHA F和HBHA R分別引入BamH I和SalI，同時(shí)去掉HBHA基因的終止密碼TAG；由于hIL12是由P40和P35兩個(gè)亞基組成，為了保證HBHA和hIL12兩亞基的正確折疊，分別在hIL12 P40 F和hIL12 P35 F的引入48 bp和30 bp的Linker及SalI和SphI位點(diǎn)，同時(shí)在hIL12 P40 R突變掉TAG終止密碼。考慮到后續(xù)穿梭載體的構(gòu)建，我們利用巢式PCR對(duì)P35基因542 bp處的BamH I進(jìn)行點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)。利用巢式PCR對(duì)BamH I進(jìn)行點(diǎn)突變。

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列Table 1 Primers used in thisstuy

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定 以 MTB H37Rv DNA為模板PCR克隆HBHA基因，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增MTB HBHA基因。用淋巴細(xì)胞分裂液分離人淋巴細(xì)胞，RPMI－1640洗滌后加1 m L TRIzol提取中RNA，以此為模板合成cDNA作為hIL12的模板，hIL12 P40 F和hIL12 P40 R擴(kuò)增hIL12 P40基因；用hIL12 P35 F和hIL12 P35突變R擴(kuò)增P35的上游542 bp堿基，同時(shí)利用hIL12 P35突變F和hIL12 P35 R為引物擴(kuò)增下游的220 bp；而后利用兩次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物做模板，hIL12 P35 F和hIL12 P35 R為引物，擴(kuò)增點(diǎn)突變的完整hIL12 P35基因。將所有的擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后克隆至p MD18－T載體，酶切鑒定正確后由北京奧科生物有限公司測(cè)序。

1.2.3 含HBHA和hIL12基因的結(jié)核分枝桿菌穿梭載體的構(gòu)建 利用BamH I、SalI；SalI、SphI；SphI、Hind III分別酶切測(cè)序正確的p MD18THBHA、p MD18T－h(huán)IL12 P40、p MD18T－h(huán)IL12 P35。通過瓊脂糖凝膠電泳相應(yīng)的基因片段，利用T4 DNA Ligase分步亞克隆到克隆載體p EGM－3zf（＋），構(gòu)建 p EGM－3zf－HBHA－h(huán)IL12。BamH I和Hind III雙 酶 切 p EGM－3zf－HBHA－h(huán)IL12 及 結(jié) 核分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pSMT3空載體。凝膠回收HBHA－h(huán)IL12的融合基因片段及線性化的pSMT3載體。利用T4 DNA Ligase連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，潮霉素抗性篩選。通過PCR及酶切鑒定獲得陽性克隆。

1.2.4Ms感受態(tài)的制備及電穿孔轉(zhuǎn)化 將7H9培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)的Ms菌株，按1∶100的轉(zhuǎn)接至200 m L 7 H9培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2d后，按10%體積比加入2 mol/L的甘氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，冰浴1.5～2 h。4℃12 000 r/min離心20 min收集細(xì)菌。菌體用預(yù)冷的10%甘油洗滌3次后，以400μL分裝備用。取pSMT3－HBHA－h(huán)IL12質(zhì)粒200μL，加入400μL的無水乙醇和20μL醋氨酸（3 mol/L，p H5.2），混勻后－20℃冷卻沉淀30 min。4 ℃12 000 rpm/min離心30 min，沉淀用75%乙醇洗滌，－20℃冷卻15 min后4℃12 000 r/min離心20 min，白色沉淀無菌條件下風(fēng)干，加入30μL無菌水重懸后取10μL加入到Ms感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰浴10 min，在參數(shù)為2.5 KV、25μF、1000Ω的條件進(jìn)行電穿。電穿完成后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入5 m L 7 H9中振蕩培養(yǎng)4 h后加入5μL潮霉素，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將細(xì)胞涂布于含有潮霉素的7 H10平板篩選。37℃培養(yǎng)7 d左右挑選克隆進(jìn)行鑒定。

1.2.5 重組恥垢分枝桿菌的鑒定

1.2.5.1 基因型鑒定 挑選并培養(yǎng)潮霉素抗性篩選的7 H10平板克隆，收集菌液，煮沸30 min，12 000 r/min離心取上清做為模板，利用hIL12 P40 F和hIL12 P35 R為引物，進(jìn)行PCR鑒定。同時(shí)用Ms正常菌株做為陰性對(duì)照。

1.2.5.2 間接免疫熒光法鑒定 將基因型鑒定正確的陽性克隆接種于5 m L含潮霉素的7H9培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7d后收集菌體，無菌生理鹽水洗滌3次，加入正常小牛血清100μL，37℃封閉1h。無菌生理鹽水洗滌3次，加入HBHA m Ab，37℃結(jié)合2 h，離心后生理鹽水洗滌，分別加入500μL PBS和5 μL的1%Evan’s Blue及5μL FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫避光結(jié)合15 min。PBS洗滌，取3μL均勻涂片，用中性樹脂進(jìn)行封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。同時(shí)，利用hIL12 p Ab以相同的方法，觀察hIL12在Ms中的表達(dá)。均選用正常培養(yǎng)的Ms作為陰性對(duì)照。

1.2.6 重組恥垢分枝桿菌生長曲線的測(cè)定 分別轉(zhuǎn)接鑒定正確的表達(dá)HBHA－h(huán)IL12融合蛋白的重組Ms和普通Ms與20 m L 7H9培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)，每隔4 h測(cè)定一次培養(yǎng)物OD600的吸光度。測(cè)定重組恥垢分枝桿菌對(duì)細(xì)菌生長速度的影響。繪制生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 HBHA及hIL12基因的擴(kuò)增、克隆和構(gòu)建以H37Rv DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增600 bp大小的HBHA基因；此外，以人淋巴細(xì)胞總RNA為模板進(jìn)行 RT－PCR反應(yīng)，分別可擴(kuò)增獲得1 032 bp和792 bp的hIL12 P40、hIL12 P35兩個(gè)亞基，與文獻(xiàn)報(bào)道的大小基本一致，序列測(cè)定表明獲得了正確的目的基因，見圖1?？寺〉浇Y(jié)核分枝桿菌穿梭載體pSMT3中后，經(jīng)過BamH I、SalI、SphI、Hind III組合酶切鑒定，表明獲得正確的克隆，見圖2。

圖1 HBHA及h IL12 P40、h IL12 P35基因擴(kuò)增結(jié)果1：DL2000 Marker；2：HBHA基因 RCP擴(kuò)增產(chǎn)物；3：hIL12 P40基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4：hIL12 P35下游擴(kuò)增產(chǎn)物；5：hIL12 P35上游擴(kuò)增產(chǎn)物；6：hIL12 P35基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The results of amplification of HBHA，hIL12 P40 and hIL12 P351：DL2000 Marker；2：The products of HBHA；3：The products of hIL12 P40；4：The products of lower part of hIL12 P35；5：The products of upper half of hIL12 P35；6：The products of hIL12 P35

圖2 重組質(zhì)粒pSMT3－HBHA－h(huán) IL12的酶切鑒定1：DL2000 Marker；2：Bam H I、Sal I雙酶切pSMT3－HBHA－h(huán)IL12質(zhì)粒；3：Sal I、Sph I雙酶切 pSMT3－HBHA－h(huán)IL12；4：Sph I、Hin d III雙酶切切 pSMT3－HBHA－h(huán)IL12質(zhì) 粒；5：Bam H I、Hin d III雙 酶 切pSMT3－HBHA－h(huán)IL12鑒定Fig.2 Recombinant plasmid pSMT3－HBHA－h(huán)IL12 by endounclease digestion1：DL2000 Marker；2： Recombinant plasmid pSMT3－HBHA－h(huán)IL12 by Bam H I and Sal I digestion；3：The recombinant plasmid digestioned by Sal I and Sph I；4：Recombinant plasmid digestioned by Sph I and Hin d III；5：The recombinant plasmid digestioned by Bam H I and Hin d III

2.2 重組恥垢分枝桿菌的篩選和鑒定 轉(zhuǎn)接酶切和測(cè)序鑒定正確的陽性克隆，37℃培養(yǎng)7 d，收集菌液，提取重組恥垢分枝桿菌基因組DNA。分別以hIL12 P40 F、hIL12 P40 R以及hIL12 P35 F和hIL12 P35 R為引物，進(jìn)行重組恥垢分枝桿菌的基因鑒定，成功擴(kuò)增出1 032 bp的hIL12 P40和792 bp的hIL12 P35。用正常培養(yǎng)的Ms作為陰性對(duì)照，未能擴(kuò)增出任何條帶，見圖3。此外，再通過HBHA m Ab和hIL12 m Ab分別進(jìn)行了間接性免疫熒光檢測(cè)。均發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)蛋白的表達(dá)，見圖4。

圖3 HBHA－h(huán) IL12－r Ms的基因型鑒定1：DL2000 Marker；2：從 HBHA－h(huán) IL12－r Ms基因組擴(kuò)增hIL12P40鑒定；3：從 HBHA－h(huán) IL12－r Ms基因組擴(kuò)增hIL12P35鑒定；4：從 HBHA－h(huán) IL12－r Ms基因組擴(kuò)增hIL12鑒定；5：Ms陰性對(duì)照Fig.3 Identification of the genotype of the recombinant Mycobacterium smegmatis HBHA－h(huán) IL12－r Ms1：DL2 000 Marker；2：The product of h IL12 P40 in HBHA－h(huán) IL12－r Ms；3：The product of h IL12 P35 in HBHA－h(huán) IL12－r Ms；4：The product of h IL12 in HBHA－h(huán) IL12－r Ms；5：Negative control by Ms

圖4 免疫熒光鑒定HBHA和h IL12蛋白在Ms的表達(dá)（1 000×）A：HBHA單克隆抗體結(jié)合Ms免疫熒光；B：HBHA單克隆抗體結(jié)核HBHA－h(huán) IL12－r Ms重組恥垢分枝桿菌免疫熒光；C：hIL12多克隆抗體結(jié)合Ms免疫熒光；D：hIL12 多 克 隆 抗 體 結(jié) 合 HBHA－h(huán) IL12－r Ms 免 疫熒光Fig.4 The immunofluorescence identification of the expression of protein in r Ms（1 000×）A：Banding of Ms（Negative control）with anti－HBHA m Ab；B：Banding of HBHA－h(huán) IL12－r Ms with anti－HBHA m Ab；C：Banding of Ms with antihIL12 Pc Ab；D：Banding of HBHA－h(huán)IL12－r Ms with anti－h(huán)IL12 Pc Ab

圖5 重組HBHA－h(huán)IL－12－r Ms與正常Ms生長速度的改變Fig.5 The change of growth rate about the HBHA－h(huán)IL－12－r Ms and Ms

2.3 重組恥垢分枝桿菌的生長特性改變 結(jié)果如圖5所示，可以看出與Ms相比較，重組HBHA－h(huán)IL－12－r Ms的生長速度明顯加快。

3 討 論

將外源基因?qū)敕种U菌構(gòu)建成重組分枝桿菌是結(jié)核疫苗改造的重要方向之一，目前常用的活疫苗載體主要包括分枝桿菌屬、沙門菌、痘苗病毒等，使用分枝桿菌為載體的活疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）所表達(dá)的保護(hù)性抗原不需純化，可直接用于免疫，免去了蛋白質(zhì)處理的復(fù)雜過程；（2）活疫苗可在體內(nèi)長期存活并不斷表達(dá)外源抗原，單次接種即可持續(xù)誘導(dǎo)對(duì)靶抗原的反應(yīng)；（3）可根據(jù)需要對(duì)靶抗原進(jìn)行修飾；（4）分枝桿菌本身可作為一種強(qiáng)免疫佐劑，提高宿主的免疫力。該方法主要利用基因工程技術(shù)將幾種外源基因?qū)敕种U菌中，依靠宿主表達(dá)外源抗原，以誘導(dǎo)對(duì)疾病的特異性體液和細(xì)胞免疫［4－5］。由于BCG生長緩慢，細(xì)胞壁厚且富含脂質(zhì)，對(duì)之進(jìn)行基因操作比較困難，因此我們更加關(guān)注非致病的恥垢分枝桿菌。許多實(shí)驗(yàn)已證實(shí)應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)是安全的。在美國Ms作為疫苗佐劑已成功用于TB的預(yù)防和治療，證明了Ms作為活載體疫苗的安全性和可靠性。此外，Ms生長速率快，表達(dá)產(chǎn)量高，而且在Ms中表達(dá)的MTB相關(guān)蛋白與天然蛋白的生化及免疫學(xué)特性幾乎完全一致［6］。因此，重組恥垢分枝桿菌活疫苗用于MTB感染的治療時(shí)，可以通過恢復(fù)保護(hù)性免疫，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的H2O2和NO，有效清除MTB，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力；還可改變免疫應(yīng)答的Th1/Th2模式，使免疫應(yīng)答從Th2型向Th1型偏移，從而有助于機(jī)體免疫細(xì)胞殺滅MTB，縮短療程。但由于結(jié)核病本身就是一種免疫性疾病，本研究將人IL12基因與結(jié)核分子桿菌優(yōu)勢(shì)抗原HBHA融合表達(dá)，顯著增強(qiáng)其免疫效果，而這種增強(qiáng)的免疫效應(yīng)對(duì)機(jī)體是否有影響，我們將在后期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行相應(yīng)的安全性驗(yàn)證。

HBHA是目前已報(bào)道的具有治療效果的MTB靶抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答，減少感染動(dòng)物主要臟器的荷菌數(shù)。并誘導(dǎo)潛伏感染患者特異性CD8＋T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生穿孔素、TNF－α及IFN－γ等細(xì)胞因子。在治療潛伏性結(jié)核感染方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。hIL－12在針對(duì)胞內(nèi)菌的細(xì)胞免疫中起著關(guān)鍵作用，它可誘導(dǎo)靜止及活化的NK及T細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ，促進(jìn)NK及T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促使CTL細(xì)胞的成熟，并激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)入侵MTB的殺傷作用，且已經(jīng)作為輔助手段用于結(jié)核病的治療。本研究通過構(gòu)建表達(dá)HBHA－h(huán)IL－12融合基因的HBHA－h(huán)IL－12－r Ms，以恥垢分枝桿菌為宿主細(xì)胞，持續(xù)分泌具有生物活性的HBHA－h(huán)IL－12融合蛋白；將重組的恥垢分枝桿菌與HBHA單抗和人IL－12抗體反應(yīng)，進(jìn)行免疫熒光鑒定，證實(shí)兩種蛋白的表達(dá)。通過連續(xù)培養(yǎng)監(jiān)測(cè) HBHA－h(huán)IL－12－r Ms的生長曲線，結(jié)果表明重組Ms的生長速度明顯增強(qiáng)。我們進(jìn)一步通過對(duì)重組Ms的第2、4、6代分泌的HBHA－h(huán)IL－12分別與HBHA單抗和hIL－12抗體作用均有反應(yīng)（結(jié)果未發(fā)表）。證實(shí)了在重組Ms中表達(dá)的穩(wěn)定性。

融合基因表達(dá)產(chǎn)物可有效提高單個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原的治療效果，已被證實(shí)具有明顯的協(xié)同和增強(qiáng)作用。本研究以恥垢分枝桿菌作為宿主細(xì)胞，持續(xù)分泌具有生物活性的 HBHA－h(huán)IL－12融合蛋白；一方面可使hIL－12在體內(nèi)持續(xù)存在，特異性的促進(jìn)IFN－γ的分泌，促進(jìn)NK及T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，促使CTL細(xì)胞的成熟［7－8］。增強(qiáng)宿主對(duì)MTB的免疫應(yīng)答；另一方面可發(fā)揮其載體效應(yīng)，促進(jìn)HBHA誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)力和免疫應(yīng)答，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)入侵MTB的殺傷作用。從而達(dá)到控制體內(nèi)MTB的目的。

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