程莉莉，黃文功

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086）

亞麻是我國(guó)重要的纖維和油料經(jīng)濟(jì)作物。常規(guī)育種技術(shù)在提高亞麻的主要性狀指標(biāo)方面取得了一定的進(jìn)展[1]。將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種手段相結(jié)合，有助于解決一些常規(guī)育種方法難以解決的特殊問(wèn)題[2]。目前，亞麻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在基礎(chǔ)研究及定向培育優(yōu)良品種的應(yīng)用方面已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注。建立良好的亞麻再生體系是亞麻遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中十分重要的研究。本文以黑亞14為試驗(yàn)材料，研究了不同消毒時(shí)間對(duì)種子消毒及萌發(fā)的影響以及不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化及不定芽伸長(zhǎng)的影響。篩選出了最適的種子消毒時(shí)間、愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基以及不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基。旨在優(yōu)化亞麻組織培養(yǎng)的再生體系，為亞麻遺傳轉(zhuǎn)化提供良好的組織培養(yǎng)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試亞麻品種為黑亞14，由黑龍江省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

萌發(fā)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8；

愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+(0.05、0.1)mg·L-1NAA+(1、2)mg·L-16-BA+(0、0.5、1.0)mg·L-1KT+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒和萌發(fā)

挑選成熟、飽滿(mǎn)的黑亞14種子，配制70%乙醇及10%次氯酸鈉溶液，設(shè)置不同的消毒時(shí)間進(jìn)行種子表面消毒，每處理使用120粒種子，分3次重復(fù)，每重復(fù)40粒。先將亞麻種子直接放入70%乙醇中浸泡0.5min或1.0min，然后將種子放入10%次氯酸鈉溶液中消毒15min、20min或25min，消毒期間應(yīng)上下混勻3-4次，消毒后將種子用無(wú)菌水沖洗3次，將消毒后的種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，進(jìn)行5天的暗培養(yǎng)及2天的16h光照/8h暗培養(yǎng)。觀察無(wú)菌苗的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)不同消毒處理下種子的發(fā)芽率及污染情況。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)及分化

以MS為基本培養(yǎng)基，采用不同NAA、6-BA和KT濃度組合配制愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下，切取萌發(fā)7天的亞麻無(wú)菌苗的下胚軸做為外植體材料，接入到愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，每種激素組合接種8瓶，每瓶培養(yǎng)基中接種5個(gè)外植體，接種的總個(gè)數(shù)均為40個(gè)。兩周繼代1次，14天后觀察愈傷組織誘導(dǎo)及分化情況，30天后觀察愈傷組織上誘導(dǎo)的不定芽情況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出芽率。

1.2.3 不定芽的伸長(zhǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，采用不同NAA、6-BA和KT濃度組合配制不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，在愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.05mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8條件下，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的外植體接入到不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中，每種激素組合接種8瓶，每瓶培養(yǎng)基中接種5個(gè)外植體，接種的總個(gè)數(shù)均為40個(gè)。兩周繼代一次，30天后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽伸長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子消毒對(duì)種子萌發(fā)的影響

通過(guò)6個(gè)處理對(duì)亞麻種子進(jìn)行消毒，隨著乙醇浸泡時(shí)間及次氯酸鈉消毒時(shí)間的增加，種子的萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)，種子消毒效果越來(lái)越好（表1）。相比于乙醇溶液中浸泡1min條件，在乙醇溶液中浸泡0.5min條件下雖然種子的平均發(fā)芽率整體水平較高，但種子帶菌情況嚴(yán)重，造成種子材料的浪費(fèi)，因此確定乙醇浸泡的時(shí)間為1min。隨著次氯酸鈉消毒時(shí)間的增加，種子的帶菌情況減少，但平均發(fā)芽率也隨之下降，因此綜合種子萌發(fā)及消毒后種子帶菌情況，確定種子放入10%次氯酸鈉的消毒時(shí)間為20min。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)種子消毒及萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of different times on seed disinfection and germination

2.2 不同激素配比對(duì)亞麻愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響

下胚軸接種于不同激素配比的愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)，下胚軸都能誘導(dǎo)出愈傷組織。但愈傷組織形成的時(shí)間有所不同，放入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基14d后，NAA濃度為0.05 mg·L-1條件下與NAA濃度為0.1mg·L-1條件下相比，愈傷組織的形成整體較快。誘導(dǎo)培養(yǎng)30天后（圖1）統(tǒng)計(jì)含有不定芽的外植體并且計(jì)算誘導(dǎo)出芽率（表2），在NAA、BA和KT的不同濃度配比下，篩選出最適愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，即激素添加量為：NAA濃度為0.05 mg·L-1和6-BA濃度為2mg·L-1，此條件下愈傷組織形成較快、誘導(dǎo)出芽率較高并且每個(gè)愈傷組織上誘導(dǎo)出不定芽的數(shù)量較多。

表2 不同激素配比對(duì)愈傷組織分化的影響Tab.2 Effect of different hormone concentrations on callus differentiation

2.3 不同激素配比對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響

下胚軸進(jìn)行30天誘導(dǎo)分化形成帶有不定芽的愈傷組織，將外植體移至不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織上已伸長(zhǎng)至1.5cm以上的植株數(shù)（圖2）及相關(guān)外植體數(shù)。表3中相關(guān)數(shù)據(jù)表明，在NAA濃度0.05 mg·L-1、6-BA濃度1 mg·L-1和KT濃度1 mg·L-1條件下，外植體中平均伸長(zhǎng)植株數(shù)較多，但外植體總數(shù)中含有伸長(zhǎng)植株的外植體比例并不是最高；在NAA濃度0.1 mg·L-1和6-BA濃度1 mg·L-1條件下，外植體總數(shù)中含有伸長(zhǎng)植株的外植體比例相比其它處理為最高。因此確定出最適不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中激素添加量為：NAA0.1 mg·L-1和6-BA 1mg·L-1。

表3 不同激素配比對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of different hormone concentrations on adventitious shoot elongation

3 討論

獲得無(wú)菌苗是進(jìn)行亞麻組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的首要步驟，利用70%乙醇溶液浸泡后再經(jīng)過(guò)10%次氯酸鈉溶液消毒是亞麻種子消毒的一種常用方法。不同基因型的亞麻所需要的消毒時(shí)間不同[3]，這與本身種子的萌發(fā)情況及帶菌情況相關(guān)，因此在確定種子消毒時(shí)間時(shí)應(yīng)考慮萌發(fā)及污染兩方面因素，即確保外植體材料具有足夠的使用量，減少種子材料的浪費(fèi)。

圖1 不定芽的誘導(dǎo)Fig.1 Adventitious shoot induction

圖2 不定芽的伸長(zhǎng)Fig.2 Adventitious shoot elongation

植物組織培養(yǎng)中，常用的植物激素有NAA、6-BA、KT、IBA、2、4-D等[4]，不同濃度的激素配比對(duì)亞麻愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽的誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)是有影響的，配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)綜合考慮，協(xié)調(diào)植物激素間的組配比例及使用量，使植物組織培養(yǎng)得到相應(yīng)的預(yù)期效果。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基以及不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中NAA和6-BA的配合使用及其濃度配比對(duì)不定芽的誘導(dǎo)及伸長(zhǎng)起著重要作用。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)亞麻品種黑亞14進(jìn)行再生條件的優(yōu)化研究，黑亞14的最適的種子消毒條件為70%乙醇浸泡1.0min，10%次氯酸鈉消毒20min。最適愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.05mg·L-1NAA+2mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8。最適不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.1mg·L-1NAA+1mg·L-16-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8。

[1]姬妍茹.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].黑龍江紡織,2008,3:(4-8).

[2]張志揚(yáng),陳信波,張瑜,等.亞麻組織培養(yǎng)高頻不定芽誘導(dǎo)體系[J].植物學(xué)通報(bào),2007,24(5):629-635.

[3]王克臣.亞麻離體再生及早期體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008：109-110.

[4]王克臣,冷超,李明.亞麻離體再生體系的建立及優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(14):7195-7199.