蔣莉萍,袁金蘭,肖 鳳,張萬(wàn)興,劉 菅

(1.吉安市婦幼保健院 病理科,江西吉安 343000;2.井岡山大學(xué) 病理教研室）

葡萄胎(hydatidiform mole,HM）是妊娠滋養(yǎng)層疾病中最為常見(jiàn)的疾病。我國(guó)HM的發(fā)病率為1∶1 290次妊娠[1]。葡萄胎在＞40歲的婦女最多,并且在那些＜20歲婦女的發(fā)病率也有增加。據(jù)估計(jì),完全性葡萄胎約20%發(fā)展為持續(xù)性妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病,多數(shù)發(fā)展為持續(xù)性或侵襲性胎塊,1%-2%的完全性葡萄胎可發(fā)展為絨癌。部分性葡萄胎發(fā)展為絨癌的危險(xiǎn)性非常低,世界上僅有幾例記錄較完全的報(bào)道。由于完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole,CHM）和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole,PHM）的惡變率存在顯著的差異,臨床上很有必要將兩者準(zhǔn)確地區(qū)別開(kāi)來(lái)。因早期完全性葡萄胎與部分性葡萄胎的組織學(xué)表現(xiàn)有許多相似之處,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)方法首次聯(lián)合檢測(cè)P57、P53蛋白在CHM與PHM中的表達(dá)情況,尋找高敏感度和高特異性的葡萄胎標(biāo)志物并探討兩者在診斷中的應(yīng)用價(jià)值及相互關(guān)系,為臨床診斷和治療提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象70例水泡狀胎塊標(biāo)本,選自2006年-2008年江西省吉安市婦幼保健院病理科歸檔蠟塊,標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋,HE染色。所有病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO(2003）乳腺及女性生殖器官腫瘤分類,HE切片由2名高年資婦產(chǎn)科病理醫(yī)師讀片,排除組織量少診斷有差異的病例。其中,完全性葡萄胎51例,平均年齡28.8歲(19-51歲）;部分性葡萄胎19例,平均年齡26.3歲(19-36歲）;門診隨機(jī)選取30例正常早孕胎盤(6-9w）(normal placeta,NP）作為對(duì)照,平均年齡27.5歲(19-39）。

1.2 試劑與方法

鼠抗人單克隆抗體P57kip2(單克隆號(hào):25B2）,兔抗人單克隆抗體P53(單克隆號(hào):SP5）和SP試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用免疫組化S-P法。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn) P53、P57染色陽(yáng)性物質(zhì)均位于細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果判定經(jīng)兩名高年資的婦產(chǎn)科病理醫(yī)師交叉閱片綜合分析判斷。

1.3.2 染色陽(yáng)性率的計(jì)算 先在低倍鏡(100×）下選取細(xì)胞分布均勻的視野,再在高倍鏡(400×）下,用Image-pro plus病理彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,分別測(cè)出每個(gè)視野中陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù),每例分別隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野,計(jì)算均值,以百分?jǐn)?shù)表示,即陽(yáng)性率=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/瘤細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3.3 免疫組化結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用AB值法,A為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí):0-1%=0、1-10%=1、10-50%=2、50-80%=3、80%-100%=4;B 為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí):0(陰性）、1(弱陽(yáng)性）、2(陽(yáng)性）、3(強(qiáng)陽(yáng)性）,每例免疫組化最終評(píng)分值HIS=A×B。將HIS最終評(píng)分值再分類,以“HIS＜3”判定為“無(wú)明顯表達(dá)”,以“3≤HIS＜5”判定為低度表達(dá),以“5≤HIS＜7”判定為中度表達(dá),以“HIS≥7”判定為高度表達(dá)。其中,以“HIS ＜5” 判為低表達(dá),以“HIS≥5”判為高表達(dá);將中、高度陽(yáng)性表達(dá)率作為過(guò)表達(dá)陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和數(shù)據(jù)分析均采用SPSS13.00軟件(采用卡方檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析）。

2 結(jié)果

2.1 P57的表達(dá)

P57的定位很有特點(diǎn),在CHM中僅在絨毛間滋養(yǎng)層細(xì)胞島、蛻膜細(xì)胞間偶見(jiàn)點(diǎn)灶狀微弱著色。在高度水腫的絨毛間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞以及絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞P57均不表達(dá),而在PHM中水腫的絨毛間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞P57呈陽(yáng)性表達(dá),周圍形態(tài)正常絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、絨毛間質(zhì)細(xì)胞以及絨毛間滋養(yǎng)細(xì)胞島P57也呈陽(yáng)性表達(dá)為,兩種絨毛的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞P57均不表達(dá)。表1中,CHM、PHM以及對(duì)照組(NP）的P57陽(yáng)性表達(dá)率分別為0%、89.47%、以及100%。其中,CHM與PHM比較差異,χ2=55.500,P＜0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHM 與NP比較差異,χ2=81.000,P＜0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PHM與NP比較差異,χ2=2.452,P＞0.01,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 P53的表達(dá)

P53蛋白主要在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和中間型滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá),合體滋養(yǎng)層細(xì)胞基本不表達(dá)。表1中CHM、PHM及NP中P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為94.12%、42.11%、以及 16.67%,組間兩兩比較,CHM與PHM比較差異,χ2=20.268,P＜0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHM與NP比較差異,χ2=50.095,P＜0.01,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PHM 與NP比較差異,χ2=3.862,P＞0.01,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 在CHM中滋養(yǎng)層細(xì)胞不同增生程度間P57蛋白、P53蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 P53蛋白與P57蛋白在CHM、PHM 中的相關(guān)性,經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)性分析,P＞0.05,無(wú)關(guān)聯(lián)性。見(jiàn)表3。

表1 兩型葡萄胎組織P53和P57表達(dá)情況

表2 完全性葡萄胎組中滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生程度與P53、P57表達(dá)的關(guān)系

表3 兩型葡萄胎組織P53與P57基因表達(dá)的關(guān)系

3 討論

P53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因,其基因產(chǎn)物P53蛋白主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),是細(xì)胞生長(zhǎng)重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子,也是引起細(xì)胞程序性死亡的重要原因。在腫瘤早期形成階段,由于體內(nèi)外各種致癌因素的作用,P53基因發(fā)生缺失突變,使其編碼的蛋白質(zhì)喪失了抑制細(xì)胞增殖的功能,導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖而引發(fā)腫瘤。P57kip2又叫有絲分裂因子,是細(xì)胞周期抑制因子和腫瘤抑制因子,其編碼產(chǎn)物是一種廣泛的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK）的抑制蛋白,即稱為P57kip2蛋白或P57蛋白。在正常情況下,P57kip2基因?yàn)楦冈葱曰蛴∮?母源性基因表達(dá)[2]。P57蛋白通過(guò)與CDK結(jié)合抑制CDK的功能使細(xì)胞周期停滯在G1期。因而人們認(rèn)為,P57kip2可能是一個(gè)新型的腫瘤抑制基因,能抑制細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)化[3]。P57kip2基因參與細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化[4]。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了51例CHM,19例PHM及30例正常早孕胎盤組織中P57、P53的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,P57在CHM與PHM組織中的表達(dá)分布具有明顯的差異。P57在CHM組織中的表達(dá)僅位于絨毛間滋養(yǎng)層細(xì)胞島、蛻膜細(xì)胞間偶見(jiàn)點(diǎn)灶狀的微弱著色,在高度水腫的絨毛間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛合體滋養(yǎng)層細(xì)胞P57均不表達(dá)。在51例CHM中,P57均呈“無(wú)明顯表達(dá)”。而P57在PHM的表達(dá)分布很有特點(diǎn),即水腫的絨毛間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞P57陰性表達(dá),周圍形態(tài)正常絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、絨毛間質(zhì)細(xì)胞和絨毛間滋養(yǎng)細(xì)胞島P57陽(yáng)性表達(dá),兩種絨毛的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞P57均不表達(dá)[5]。在PHM水腫的絨毛間滋養(yǎng)葉細(xì)胞島和蛻膜細(xì)胞團(tuán)P57也呈陽(yáng)性表達(dá),筆者認(rèn)為,P57在CHM和PHM中絨毛間滋養(yǎng)葉細(xì)胞島和蛻膜細(xì)胞團(tuán)間的表達(dá)可能是中間型滋養(yǎng)葉細(xì)胞表達(dá)。在19例PHM組織中,僅有2例的IHS最終評(píng)分值分別為“1”和“2”,可能為抗原丟失了導(dǎo)致表達(dá)很弱,其余17例P57的表達(dá)以強(qiáng)陽(yáng)性為主。PHM的陽(yáng)性表達(dá)率為89.47%,而CHM的陽(yáng)性表達(dá)率為0%,有極顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。P57在NP中的表達(dá)分布與PHM組織中的正常絨毛組織具有相同的特點(diǎn),其陽(yáng)性表達(dá)率為100%,與PHM比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01）,這與細(xì)胞遺傳學(xué)研究結(jié)果相一致。CHMS染色體組為二倍體,46XX,其兩條染色體均來(lái)自父性,P57不表達(dá);PHMS染色體組為三倍體,一條來(lái)自母性,兩條來(lái)自父性,P57表達(dá);正常早孕絨毛組織為正常核型,各來(lái)自父系和母系,P57表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中的CHM與PHM及NP的P57的表達(dá)分布的明顯差異,提示P57蛋白的檢測(cè)可作為CHM和PHM鑒別診斷很有效的手段,具有很高的靈敏度和特異性,可以將早期的CHM和PHM區(qū)別開(kāi)來(lái)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示,在CHM和PHM中P57與P53蛋白的表達(dá)均無(wú)關(guān)聯(lián)性。然而現(xiàn)在許多腫瘤中均發(fā)現(xiàn)P57kip2基因印記缺失或印記錯(cuò)誤,導(dǎo)致基因表達(dá)下降,這表明其在腫瘤中的表達(dá)缺失可能促進(jìn)了腫瘤的增殖[6]。表2中,在51例CHM 中,由輕度滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生→中度滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生→重度滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生,P53的過(guò)表達(dá)陽(yáng)性率由50%→86.67%→100%,雖然三者的比較無(wú)差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01）,P53蛋白表達(dá)水平與CHM中滋養(yǎng)層細(xì)胞增生程度無(wú)關(guān),但其表達(dá)水平呈遞增趨勢(shì),而且從表1中顯示從NP→PHM→CHM,P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率由16.67%→42.11%→94.12%亦呈增高趨勢(shì)。其中NP與PHM兩者比較無(wú)差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01）,CHM與NP及PHM與比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。Halperin等報(bào)道 P53在NP、PHM及CHM中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 30%、50%及100%,Qiao等研究中,P53在NP中的表達(dá)低于CHM中。研究結(jié)果表明P53蛋白異常表達(dá)與葡萄胎組織的發(fā)生與進(jìn)展有關(guān),P53功能異常能明顯地促進(jìn)細(xì)胞的增殖,凋亡失衡及惡性轉(zhuǎn)化[7]。以上研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。但筆者認(rèn)為,CHMS中P57不表達(dá),可能還存在其它分子的調(diào)控機(jī)制,這與P53蛋白的表達(dá)趨于加強(qiáng)有無(wú)關(guān)聯(lián),還須待以后進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述,P57kip2基因印證缺失或印證錯(cuò)誤可能促進(jìn)了腫瘤的增殖,P53功能異常在HMS發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用。因此,P57蛋白可作為CHM和PHM鑒別診斷的一個(gè)客觀的輔助指標(biāo),P53蛋白也是個(gè)有一定臨床價(jià)值的參考標(biāo)記,值得在今后病理診斷常規(guī)工作中推廣使用。

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