蒿廣德,劉 敏,齊文玲,蒲麗蓉

(廣元市第一人民醫(yī)院輸血科,四川廣元 628017）

隨著成分輸血的不斷深入推廣應(yīng)用,血小板輸血已成為臨床輸血治療的重要手段之一,在血小板質(zhì)量和數(shù)量存在問(wèn)題的疾病治療中發(fā)揮了重要的作用。人類血小板同種抗原(human platelet alloantigens,HPA）位于血小板膜糖蛋白上,這些蛋白是由遺傳決定的,HPA的基因頻率在不同種族、不同區(qū)域中的分布是不同的。在臨床血小板輸血過(guò)程中,如果血小板同種抗原不相匹配[1],可導(dǎo)致受血者機(jī)體產(chǎn)生血小板同種抗體,引起同種免疫血小板減少綜合癥、輸血后紫癜、血小板輸注無(wú)效等。目前檢測(cè)出的24個(gè)HPA抗原中除HPA-14bw抗原是由于在核苷酸1901到1911位置上AAG等3個(gè)堿基缺失外,其他抗原均由于單核苷酸取代而產(chǎn)生。鑒于HPA在血小板輸血中的重要意義,現(xiàn)對(duì)四川省廣元市113名固定血小板獻(xiàn)血員HPA-9進(jìn)行基因分型,報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本收集128名四川省廣元市固定血小板獻(xiàn)血者,漢族,相互之間無(wú)血緣關(guān)系。采集每個(gè)血小板供者300 μ l全血,EDTA 抗凝 。

1.2 試劑與儀器設(shè)備Bio-RAD my cycler PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD,USA）,凝膠成像系統(tǒng)(UVP,USA）。

1.3 基因組DNA的提取按北京天根DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作提取DNA,每份標(biāo)本溶解于30 μ l TB溶液中。

1.4 HPA-9基因分型HPA-9基因分型使用G&T公司試劑,HPA-9基因分型分為HPA-9a和HPA-9b基因檢測(cè),內(nèi)對(duì)照是人類生長(zhǎng)激素,產(chǎn)物大小為429 bp,HPA-9基因檢測(cè)產(chǎn)物大小為196 bp。HPA-9基因分型基因檢測(cè)根據(jù)PCR產(chǎn)物的有無(wú)以及產(chǎn)物是否是預(yù)期大小一致的片段來(lái)判斷基因分型。根據(jù)說(shuō)明書反應(yīng)體系為 10 μ l,引物混合物 7 μ l,DNA1 μ l(20-50 ng）,Taq酶1 μ l(0.25 u）。擴(kuò)增參數(shù):按94℃變性3 min;94℃,30 s、60℃,30 s、72℃,90 s;30 個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min;4℃循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增。

1.5 電泳擴(kuò)增結(jié)束后PCR產(chǎn)物 5 μ l在2%的瓊脂糖內(nèi)點(diǎn)樣,使用0.5×TBE緩沖液中150V電泳20 min結(jié)束電泳,凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析基因頻率是指一個(gè)群體中某類等位基因的數(shù)量占該基因位點(diǎn)上全部等位基因的比率。等位基因頻率f(a）=[2×純合子+雜合子]/[2×總個(gè)數(shù)],f(b）=1-f(a）;基因型頻率是指一個(gè)群體中某一基因型的個(gè)體占群體中全部個(gè)體的比率。不同國(guó)家和地區(qū)人群間基因頻率的比較采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 12.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(精確概率法）,基因型之間的比較采用 χ2檢驗(yàn)的構(gòu)成比的比較。以P＜0.05為有差異,P＜0.01為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果調(diào)查的128名四川廣元漢族固定血小板供者基因分型結(jié)果全部是HPA-9aa,未檢測(cè)到HPA-9bw,調(diào)查人群基因型分布結(jié)果符合Hardy-Weinberg定律[2]。該地區(qū)HPA-9的基因頻率是1.0,HPA-9b的基因頻率是0,見(jiàn)表1。

2.2 四川廣元市漢族人群HPA-9基因頻率與不同國(guó)家和地區(qū)人群調(diào)查比較 四川廣元市漢族人群HPA-9基因頻率與高加索人、臺(tái)灣地區(qū)、上海漢族、濰坊漢族及邯鄲漢族地區(qū)比較的結(jié)果P＞0.900[3-7],不存在差異,見(jiàn)表2。根據(jù)目前報(bào)道HPA-9基因分布呈單態(tài)性。

表1 四川廣元市血小板固定獻(xiàn)血員HPA-9基因分型

2.3 基因檢測(cè)電泳結(jié)果圖1中是4名四川廣元地區(qū)固定血小板獻(xiàn)血者的HPA-9基因檢測(cè)結(jié)果,如圖1所示。第一泳道為Marker,第二泳道和第三泳道是同一檢測(cè)樣本的HPA-9a、HPA-9b的基因檢測(cè)結(jié)果,依此類推是第二個(gè)、第三個(gè)和第四個(gè)樣本HPA-9基因檢測(cè)結(jié)果。128名四川廣元地區(qū)漢族基因分型結(jié)果均為HPA-9aa。

表2 四川廣元漢族與不同國(guó)家地區(qū)HPA-9基因頻率的比較

圖1 4名四川廣元地區(qū)固定血小板獻(xiàn)血者的HPA-9基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

由于血小板特異性抗原的復(fù)雜性,所以很難獲得特異性較高的單克隆抗體。HPA遺傳多態(tài)性的分子背景已經(jīng)十分清楚,是由于單核苷酸突變?cè)斐傻?這為建立相應(yīng)的基因檢測(cè)方法成為可能。本研究通過(guò)PCR-SSP技術(shù)對(duì)128名血小板獻(xiàn)血者進(jìn)行基因分型,填補(bǔ)了四川廣元地區(qū)人群HPA-9人類學(xué)資料,同時(shí)也為該地區(qū)血小板庫(kù)的建立了增加一項(xiàng)重要指標(biāo)。由于血小板上HPA的不同,在血小板輸血、妊娠或骨髓移植等刺激下可以產(chǎn)生血小板抗體。在多次輸血的患者中,約有8%的可能性產(chǎn)生血小板特異性抗體[8]。血小板抗體可造成血小板輸注無(wú)效癥、新生兒溶血病以及器官移植排斥反應(yīng)等。國(guó)外曾報(bào)道過(guò)HPA-9bw的低頻抗體[9],提示HPA-9的基因檢測(cè)的重要性。當(dāng)前我國(guó)對(duì)HPA-9抗原進(jìn)行調(diào)查的較少。我國(guó)又是一個(gè)地域遼闊、人口眾多的多民族國(guó)家,因此十分必要對(duì)HPA-9進(jìn)行大規(guī)模的調(diào)查。本調(diào)查中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)HPA-9bw,在高加索人、臺(tái)灣、上海漢族、濰坊漢族及邯鄲漢族也未見(jiàn)HPA-9bw的報(bào)道,四川廣元地區(qū)的HPA-9基因調(diào)查數(shù)據(jù)與上述地區(qū)沒(méi)有顯著差異。可能與調(diào)查人群數(shù)量均不大相關(guān),此項(xiàng)目仍需進(jìn)一步擴(kuò)大人群數(shù)量進(jìn)行調(diào)查。

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