陳道楨,許 飛,葛海燕,徐蘭蘭,潘淑靜,朱 斌*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院中心實驗室,江蘇無錫214002;

2.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳研究室,江蘇蘇州 215123）

弓形蟲病(Toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii,TOX）引起的人獸共患寄生蟲病,孕婦感染弓形蟲常致胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎。目前普遍采用ELISA檢測弓形蟲感染,但敏感性較低且特異性不足;以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)檢測雖然快速、靈敏,但普通PCR假陽性太高。LAMP是Notomi等[1]發(fā)明的一種新型核酸擴增技術(shù),具有靈敏度高,特異性強,操作簡單等優(yōu)點,本研究在建立并優(yōu)化LAMP定性檢測弓形蟲的基礎(chǔ)上,首次建立了應(yīng)用SYBR Green I定量檢測及不需電泳的直接觀察方法。

1 材料與方法

1.1 標本來源剛地弓形蟲RH株(國際強毒代表株）由南京醫(yī)科大學(xué)寄生蟲教研室王勇教授提供;57例孕婦外周血標本由蘇州市立醫(yī)院和無錫婦幼保健院提供,抽取靜脈血,EDTA抗凝,-20℃保存。

1.2 主要試劑20×SYBRGreen I購自上海捷瑞公司,限制性內(nèi)切酶SacI購自TaKaRa公司,Betaine和MgSO4購自Sigma公司,Bst DNA聚合酶購自New England Biolabs公司。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中弓形蟲B1基因序列(Accession No:AF179871）,利用在線設(shè)計軟件(http://primerexplorer.jp/e/）設(shè)計 LAMP引物,同時設(shè)計用于克隆用PCR引物,LAMP擴增區(qū)包含于克隆片段中,引物由上海博彩生物公司合成。見表1。

1.4 基因組制備及弓形蟲B1基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建抽取腹腔注射弓形蟲速殖子感染3天的小鼠腹腔液200μ l,PBS洗滌,沉淀加入細胞裂解液 ,混合后55℃水浴過夜,經(jīng)典苯酚氯仿法抽提總DNA。PCR擴增弓形蟲B1基因片段大小為351bp,回收PCR產(chǎn)物后與pBS-T載體進行A-T連接、轉(zhuǎn)化,篩選出陽性重組質(zhì)粒,送上海生物工程有限公司測序鑒定,測得OD260值,計算拷貝數(shù)。

表1 LAMP所用的引物及克隆用PCR的引物

1.5 LAMP法擴增體系的建立總反應(yīng)體積25 μ l,引物濃度為FIP、BIP各1.6 mM;B3、F3各0.2 mM,其他反應(yīng)成分為0.5 mM dNTPs,0.4M Betaine,20 mM Tris-HCl(pH8.8）,10 mMKCl,10 mM(NH4）2SO4,4 mM MgSO4,0.1%的Triton X-100,以構(gòu)建的弓形蟲B1基因片斷重組質(zhì)粒為模板,調(diào)節(jié)模板含量 ,取 5 μ l,約 105拷貝,8U Bst DNA 聚合酶 ,混勻,63℃水浴1小時。2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.6 LAMP反應(yīng)體系的特異性從兩個方面對該方法的特異性進行評估:用建立的LAMP方法分別對雙蒸水、弓形蟲基因組DNA、豬肉絳蟲基因組DNA、日本血吸蟲基因組DNA進行擴增,電泳觀察擴增結(jié)果;因在LAMP的擴增序列中含有一個Sac I的酶切位點(圖1）,對剛地弓形蟲LAMP擴增產(chǎn)物進行特異性的酶切,酶切反應(yīng)20?l體系,包括LAMP擴增產(chǎn)物 3 μ l,10 ×緩沖液 1 μ l,Sac I 1 μ l(5U）,37 ℃消化過夜。

1.7 LAMP反應(yīng)體系的靈敏性以重組質(zhì)粒為模板,濃度調(diào)整到每反應(yīng)管分別為103、102、101、100拷貝,進行LAMP反應(yīng),結(jié)束后2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 LAMP擴增產(chǎn)物的肉眼觀察將步驟5中LAMP擴增的雙蒸水、弓形蟲基因組DNA、豬肉絳蟲基因組DNA、日本血吸蟲基因組DNA產(chǎn)物保留,向每管加入 20×SYBR Green I 2 μ l,室溫下靜置 5分鐘,然后將其置于紫外光下,觀察顏色變化。

1.9 實時定量LAMP及標準曲線的建立在建立的LAMP擴增弓形蟲體系的基礎(chǔ)上,加入0.4×SYBR Green I,將陽性重組質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋,濃度梯度為107-100拷貝/μ l,分別取5 μ L,63℃反應(yīng)1小時。以起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)為x軸,以陽性反應(yīng)時間(time-to-positive,TTP）值為y軸繪制標準曲線。

1.10 LAMP方法檢測孕婦血液標本提取孕婦外周血標本總DNA,用建立的LAMP體系定性檢測,63℃水浴1小時,2%瓊脂糖凝膠電泳。LAMP擴增陽性的外周血標本進行熒光定量LAMP,根據(jù)反應(yīng)的TTP值,由標準曲線外推其弓形蟲DNA含量。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲B1基因陽性模板的制備將重組的弓形蟲B1基因陽性質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序,測序結(jié)果與GenBank中弓形蟲B1基因序列進行blast比對(比對結(jié)果未顯示）,鑒定結(jié)果表明為本實驗所需的弓形蟲B1基因630 bp-980 bp(AF 179871）,長度為351個bp,以此為建立LAMP反應(yīng)的陽性模板。

2.1 LAMP反應(yīng)檢測弓形蟲DNA體系的建立通過對影響LAMP反應(yīng)幾個主要因素的優(yōu)化,我們建立了最適的反應(yīng)體系,利用該體系,可擴增出LAMP產(chǎn)物特有的梯狀條帶。

2.3 LAMP反應(yīng)體系的特異性用建立的LAMP方法分別擴增雙蒸水、弓形蟲基因組DNA、豬肉絳蟲基因組DNA、日本血吸蟲基因組DNA,僅弓形蟲DNA出現(xiàn)擴增條帶(圖1）,進一步對擴增產(chǎn)物進行酶切,梯狀條帶消失,在預(yù)期位置出現(xiàn)2條特異條帶(圖2）。

圖1 特異性擴增圖

圖2 LAMP擴增產(chǎn)物酶切圖

2.4 LAMP反應(yīng)的敏感性檢測調(diào)整每反應(yīng)管質(zhì)粒分別為103、102、101、100拷貝 ,進行 LAMP 反應(yīng),如圖3,1、2、3泳道均可見特異梯狀條帶,但亮度漸變暗,4泳道(即反應(yīng)管中僅有100拷貝）未見特異梯狀條帶。

圖3 LAMP擴增敏感性圖

2.5 LAMP擴增產(chǎn)物顯色反應(yīng)LAMP擴增后的反應(yīng)管中加入20×SYBRGreen I 2 μ l,室溫靜止 5分鐘后紫外光下觀察顏色變化(圖略）,只有弓形蟲基因組DNA的擴增產(chǎn)物線顯綠色,而2、3、4管的擴增產(chǎn)物未變成綠色。

2.6 實時定量LAMP及標準曲線的建立反應(yīng)結(jié)束后制作標準曲線,如圖4所示,在模板濃度為105-101拷貝/μ l區(qū)間內(nèi),TTP值與相應(yīng)起始模板拷貝數(shù)之間有良好的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)0.929,擴增效率0.961。

1.7 LAMP方法檢測孕婦外周血標本在57例孕婦外周血標本中,LAMP定性檢測發(fā)現(xiàn)2例陽性,進一步對這2例陽性標本進行定量檢測,發(fā)現(xiàn)其TTP值分別是24.3和24.6,參照標準曲線,推算其濃度均約為103拷貝/μ l。

3 討論

圖4 熒光定量LAMP擴增標準曲線圖

本實驗選用的B1基因,是弓形蟲基因組中一個串聯(lián)重復(fù)的2.2 kb大小的片段,拷貝數(shù)大約35個,高度保守,是目前最為理想的靶基因選擇之一。本實驗首先制備弓形蟲B1基因重組質(zhì)粒,不但可提供建立體系的陽性模板,同時還利于體系靈敏度的確定,省去了弓形蟲速殖子計數(shù)的繁瑣[2],模板量的確定更簡單、準確。

溫度、Betaine濃度和Mg2+濃度是影響LAMP反應(yīng)三個最重要的因素,本實驗亦從這三個方面進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度影響最大,4 mM時效果最好,而溫度和Betaine濃度影響較小,與現(xiàn)大部分文獻報道的溫度或Betaine濃度是影響LAMP最主要因素不同[1,3],我們卻發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度對體系影響最大,En等[4]在建立偽狂犬病病毒檢測方法時亦發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象,可見在LAMP方法建立時按常規(guī)僅改變溫度或Betaine濃度并不一定能得到滿意結(jié)果。

LAMP的四條引物識別靶基因的六個特定區(qū)域,大大提高了擴增的特異性。如圖2所示,本體系僅弓形蟲DNA出現(xiàn)特有的梯狀條帶,而其他物種DNA擴增陰性,為保證LAMP擴增產(chǎn)物的特異性,需進一步采用酶切鑒定,如圖1所示在擴增區(qū)存在一個SacⅠ酶切位點,經(jīng)SacⅠ酶切后,梯狀條帶消失(圖3）,充分證明了我們建立的檢測體系具極高的特異性。

通過建立弓形蟲B1基因重組質(zhì)粒,可以簡單準確快速地了解LAMP擴增體系的檢測下限,如圖4所示當每反應(yīng)管模板低至10拷貝時仍可見擴增產(chǎn)物,但100拷貝(即1個拷貝）檢測不到擴增產(chǎn)物,表明我們建立的體系檢測下限為每反應(yīng)管10拷貝,與李啟明等[5]報道的相一致,表明LAMP檢測靈敏度比常規(guī)PCR要高2-3個數(shù)量級。

LAMP擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳不僅費時間,且所用的EB是致癌誘變劑,對操作人員有害。為了使 LAMP產(chǎn)物易于觀察,本實驗加入SYBR Green I,然后在紫外燈下直接觀察結(jié)果。如圖5所示陽性標本顯綠色,反之無色。該方法簡單易行,特別適合基層單位快速檢測。

LAMP反應(yīng)使dNTPs轉(zhuǎn)化為焦磷酸根,而后者又可與Mg2結(jié)合生成焦磷酸鎂沉淀,Mori等[6]發(fā)現(xiàn)該沉淀的形成與DNA的生成量呈線性關(guān)系,且焦磷酸鎂沉淀在400 nm處有吸收峰,依據(jù)此原理可使用濁度儀進行LAMP的定量檢測。但是,濁度儀價格昂貴,難以普及。與PCR相似,LAMP產(chǎn)物亦為雙鏈DNA,SYBRGreen I可摻入其中,其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量,而且LAMP在60℃以上反應(yīng),與PCR相比,不易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物和二聚體,定量結(jié)果更準確?；谝陨显?Cai等[7,8]報道了利用SYBR Green I—LAMP定量檢測血清中的乙型肝炎病毒方法。但與PCR經(jīng)多個循環(huán)擴增不同,LAMP在同一溫度進行,此時采用Ct值反映檢測信號顯然是不適合的,因此引入陽性反應(yīng)時間(Timeto-positive,TTP）的概念,即擴增產(chǎn)物達到檢測閾值的時間點,類似于實時PCR的Ct值[9]。本實驗也建立了LAMP熒光定量檢測弓形蟲DNA的方法,由圖6可知標準曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.929,擴增效率0.960,表明我們建立的定量方法是可靠的,且具有較高的擴增效率。

為驗證該方法應(yīng)用價值,我們利用建立的LAMP方法對57例孕婦外周血標本進行檢測,在定性檢測到2例標本有特異擴增,進一步對這2例標本進行定量檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性率達3.5%(2/57）,與潘衛(wèi)慶等[10]報道的孕產(chǎn)婦弓形蟲感染率3.44%相近。作為方法的初步應(yīng)用,雖然檢測的標本數(shù)不多,但表明我們建立的方法具有有效、快速、靈敏等優(yōu)點,適合于基層醫(yī)院使用。

總之,本研究建立的定性及定量檢測弓形蟲基因組DNA的LAMP方法,特異性強、敏感性高、簡便快速且低成本,有望在臨床應(yīng)用發(fā)揮一定的作用。對于防止孕婦流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形等,以及提高人口素質(zhì)有著重要的價值和現(xiàn)實意義。

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