劉紅敏,陳旭東,華新宇

(漯河醫(yī)學高等專科學校組織胚胎學教研室,河南漯河 462002）

近年來雖然胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、骨髓基質(zhì)細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)病變已取了成績,但胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞取材難,且有倫理方面和移植后易形成瘤的困擾,而骨髓基質(zhì)細胞要跨胚層分化且取材時對機體損傷大,對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療也不盡人意。近年來研究證明人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells,hAECs）具有部分胚胎干細胞特性[1-2],可分化為3個胚層不同類型的細胞[3-6],誘導(dǎo)劑和方法被認為是關(guān)鍵因素。本實驗比較了兩種化學誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人羊膜細胞向神經(jīng)細胞方向分化的情況,以尋求一種較為理想的誘導(dǎo)劑及方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MEM培養(yǎng)基購自(美國Gibico公司）;人羊膜上皮細胞WISH細胞株購于中國科學院上海生命科學研究所;小鼠抗人NSE、GFAP單克隆抗體、兔抗鼠SP-Kit檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(棕黃色）均購于北京中杉金橋生物工程公司;胎牛血清(購自杭州四季青生物工程材料有限公司）;堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF）、全反式維甲酸(alltransretinoic acid,ATRA）、丁酸羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA）、胰酶購于sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預(yù)誘導(dǎo)液和誘導(dǎo)液的配制 以含10%胎牛血清和10 μ g/L堿性成纖維細胞生長因子的MEM培養(yǎng)基作為預(yù)誘導(dǎo)液;以含1 μ mol/L全反式維甲酸和無血清的的MEM培養(yǎng)基作為一種誘導(dǎo)液;以200 μ mol/L丁酸羥基茴香醚和無血清的MEM培養(yǎng)基作為另一種誘導(dǎo)液。

1.2.2 細胞的準備 人羊膜WISH細胞懸于10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基,按2×104個/ml接種于25 ml培養(yǎng)瓶中,置37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h換液后,除去未貼壁的細胞和殘渣。倒置顯微鏡下觀察,待細胞生長至80%融合時用0.25%胰酶消化傳代準備誘導(dǎo)。

1.2.3 人羊膜上皮細胞誘導(dǎo)分化 預(yù)誘導(dǎo)hAECs按2×105個/ml密度接種于預(yù)先置6孔板中制備細胞爬片,每孔加含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細胞80%融合時,吸去孔中的培養(yǎng)液。將細胞分為3組,第一組為對照組,加入等量的含血清MEM培養(yǎng)基,第二組為全反式維甲酸誘導(dǎo)組加入預(yù)誘導(dǎo)液(10%胎牛血清+10 μ g/L堿性成纖維細胞生長因子+MEM培養(yǎng)基）,第三組為丁酸羥基茴香醚誘導(dǎo)組加入預(yù)誘導(dǎo)液(10%胎牛血清+10 μ g/L堿性成纖維細胞生長因子+1 mmol/L巰基乙醇+MEM培養(yǎng)基）,三組培養(yǎng)24 h。吸棄孔中液體后用D-Hank,s液洗兩次,ATRA誘導(dǎo)組加入含1 μ mol/L全反式維甲酸和無血清的的MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),BHA誘導(dǎo)組加入含200 μ mol/L丁酸羥基茴香醚和無血清的MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),對照組為等量的無血清MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫細胞化學檢測 誘導(dǎo)12 h后的細胞用0.1 MPBS洗滌2次后,用4%多聚甲醛固定30 min,用0.1%TritonX-100作用10 min,0.1M PBS洗3次,余下步驟按免疫組織化學染色試劑盒說明操作(SP法）。一抗為1∶100小鼠抗人神經(jīng)元烯醇化酶(NSE）單克隆抗體和1∶100小鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP）單克隆抗體。DAB顯色,光鏡觀察,隨機取10個不同視野(×100）,計算神經(jīng)元樣細胞占總細胞的比例,結(jié)果用(ˉx±s）表示。以PBS為一抗作陰性對照。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 各組間比較用方差分析,兩兩比較用LSD法檢驗。采用SPSS15.0軟件包完成數(shù)據(jù)分析(P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)

hAECs經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液作用24 h后,無明顯形態(tài)變化。ATRA組加入誘導(dǎo)液ATRA后,2 h后開始發(fā)生形態(tài)變化,hAECs的胞體向內(nèi)收縮,呈球形或錐形,并向周圍長出較長的突起,12 h后部分細胞出現(xiàn)雙極或多極的細胞突起,少數(shù)細胞突起末端還出現(xiàn)分支,轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃粕窠?jīng)元的形態(tài),24 h后神經(jīng)元樣細胞未見明顯增多,但少量細胞突起連接成網(wǎng)狀,誘導(dǎo)48 h后,神經(jīng)元樣細胞逐漸萎縮;而BHA組加入誘導(dǎo)液后,細胞生長速度較ATRA組慢,細胞形態(tài)幾乎無發(fā)生改變,對照組細胞一直保持寬大的多邊形狀態(tài),細胞無明顯增殖。3 d后見到不少漂浮的細胞。

2.2 誘導(dǎo)分化細胞免疫細胞化學顯色鑒定(圖1）

對照組細胞形態(tài)仍然呈寬大多邊形NSE陽性細胞,誘導(dǎo)12 h后,ATRA組NSE免疫組化顯示陽性細胞胞質(zhì)著色染為棕黃色,胞核不著色,BHA組細胞NSE陽性細胞胞質(zhì)著色染為棕黃色。誘導(dǎo)組和對照組GFAP染色基本無陽性細胞顯示。

2.3 統(tǒng)計學分析結(jié)果

每組隨機選取10個視野,統(tǒng)計分析陽性細胞率差異具有顯著性(表1）,其中以ATRA組陽性率最高,對照組陽性率最低。

3 討論

目前人羊膜上皮細胞向神經(jīng)細胞方向分化誘導(dǎo)、調(diào)控方面的研究很少,人羊膜WISH細胞來源于正常足月妊娠的人羊膜上皮細胞,對研究人羊膜上皮細胞的生物學特性有重要作用[7]。也是體外研究羊膜上皮細胞的生物特性及其功能調(diào)節(jié)的有效實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

表1 三組NSE、GFAP陽性細胞百分比例值(±s）%

表1 三組NSE、GFAP陽性細胞百分比例值(±s）%

P＜0.05

組別 NSE GFAP對照組 (38.43±1.61） 0 ATRA組 (91.86±2.62） 0 BHA 組 (63.12±1.25） 0

蔡哲[8]等研究表明羊膜組織中存在神經(jīng)干細胞特異性標記蛋白Nestin表達陽性細胞,而且其中存在已分化的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。ATRA是一種強烈的神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑,目前應(yīng)用全反式維甲酸誘導(dǎo)胚胎干細胞或骨髓基質(zhì)細胞向神經(jīng)元分化研究較多,在本研究當中,ATRA誘導(dǎo)人羊膜上皮細胞12小時后大部分hAECs可轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細胞,并有雙極和多極突起的出現(xiàn),誘導(dǎo)24 h后一些神經(jīng)元之間可形成網(wǎng)狀,結(jié)合免疫細胞化學染色結(jié)果,誘導(dǎo)12 h時,ATRA誘導(dǎo)組大部分細胞呈NSE陽性,NSE是神經(jīng)細胞的特異性標志物,與Strbing等用ATRA處理胚胎干細胞后幾乎全部細胞分化成神經(jīng)細胞的結(jié)果一致,同一時段,出現(xiàn)形態(tài)變化的hAECs數(shù)量與NSE陽性細胞數(shù)量基本一樣,提示形態(tài)和表型在誘導(dǎo)過程中都發(fā)生了明顯的變化,提示hAECs在ATRA誘導(dǎo)下,不僅從形態(tài)上,而且在分子水平上皆有向神經(jīng)元樣細胞分化的改變。BHA和巰基乙醇均為強的抗氧化劑,BHA的抗氧化作用更強,常用作神經(jīng)細胞誘導(dǎo)劑[9],本研究中BHA組陽性率低于ATRA誘導(dǎo)組但高于對照組,且BHA組NSE陽性細胞形態(tài)并未發(fā)生明顯變化。三組中GFAP標志物均呈陰性,說明誘導(dǎo)分化出的細胞不是神經(jīng)膠質(zhì)細胞。但誘導(dǎo)后的細胞是否具有神經(jīng)細胞的生理功能,成為真正意義上的神經(jīng)細胞,能否合成分泌神經(jīng)遞質(zhì),與其他細胞和組織建立突觸聯(lián)系,傳遞和接受神經(jīng)沖動從而具有神經(jīng)細胞的生理功能,還有待進一步深入研究。

血清會增加培養(yǎng)基的復(fù)雜性,抑制細胞分化[10],因此本實驗采用無血清的MEM培養(yǎng)基進行誘導(dǎo),以更有效促進hAECs分化;3 d后倒置顯微鏡下見到部分細胞漂浮,可能與誘導(dǎo)液中缺乏血清營養(yǎng)有關(guān)。

從發(fā)育生物學角度來講,人羊膜上皮細胞源于外胚層成羊膜細胞,保持著早期外胚層細胞的多潛能特性,而神經(jīng)元也來源于外胚層,分化無需跨胚層,此外,人羊膜上皮細胞源于大量被遺棄的胎盤,是再生醫(yī)學中沒有爭議的細胞來源,因此人羊膜上皮細胞可作為移植的前體細胞來源。hAECs向神經(jīng)元樣細胞誘導(dǎo)分化將有望在神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性病變疾病的治療方面打開更廣闊的應(yīng)用前景。

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