杜 靜,杜 玲,宴耀明,周 薇,陸 紅,鄒德學

(1.北京大學深圳醫(yī)院,廣東深圳 518036;2.襄樊市中醫(yī)院,湖北襄樊 441000）

隨著人們生活質(zhì)量的提高,肥胖癥與高脂血癥的發(fā)病率日趨上升,已危害到人們的身體健康和生活質(zhì)量,其防治成為當今亟待解決的問題。肥胖和高脂血癥的主要原因是能量代謝失衡。有研究表明SIK2是一種重要的脂肪組織特異性的能量調(diào)控蛋白,在脂肪細胞的能量代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。RNA干擾技術(shù)(RNA interfering,RNAi）是近年來迅速發(fā)展起來的生物技術(shù),已成為基因功能研究以及基因治療的強有力工具[2]。實驗以短發(fā)夾(Short hair RNA,shRNA）腺病毒為介導,構(gòu)建靶向干擾脂肪細胞SIK2基因的表達載體,為進一步研究SIK2的功能提供技術(shù)手段,對于了解SIK2在脂代謝中的作用和調(diào)控機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料3T3-L1細胞系購自ATCC公司。Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體和 Trizol、Adenoviral RNAi表達系統(tǒng)試劑盒購自Invitrogen公司。腺病毒純化試劑盒購自Cell Biolabs公司。二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG抗體、SIK2兔抗鼠抗體、化學發(fā)光試劑均購自Santa Cruz公司。胰蛋白酶購自Gibco公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(molony murine leukemia virus reverse transcriptase）購自 Promega公司,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF）膜購自Amersham公司,DMEM和胎牛血清購自Gibco公司。SIK2和三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成,其余試劑均購自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒的設(shè)計 單鏈oligo、引物和探針設(shè)計:參照已發(fā)表的SIK2序列(NM-015191）設(shè)計互補ss oligos和引物,見表1。

表1 單鏈oligo引物設(shè)計

Oligo正義鏈中cgaa序列和反義鏈中ttcg序列為短發(fā)夾RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu),底劃線部分序列為和穿梭質(zhì)粒連接時的接頭設(shè)計。以上序列由Invitrogen公司合成。

1.2.2 構(gòu)建shRNA重組腺病毒 單鏈oligos經(jīng)95℃變性5 min,與Invitrogen公司提供的線性化卡那霉素抗性pENTR/U6載體進行連接得到pENTR/U6-sh-RNA-SIK2穿梭質(zhì)粒,轉(zhuǎn)TOP10感受態(tài)菌擴增。挑不同單克隆菌送Invitrogen公司測序鑒定。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pENTR/U6-shRNA-SIK2質(zhì)粒進入3T3-L1細胞。Trizol提取總RNA,以三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH）的表達作為內(nèi)參(相應引物的序列見表1）。Real-time RT-PCR篩選最有效RNA干擾pENTR/U6-shRNA-SIK2質(zhì)粒。篩選得到pENTR/U6-shRNASIK2穿梭質(zhì)粒、pENTR/U6-shRNA空質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒pAd/BLOCK-iTTm-DEST進行同源重組,氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基篩選陽性克隆。以空重組質(zhì)粒作為對照,重組pAd-shRNA-SIK2質(zhì)粒經(jīng)Pacl酶切后,用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染70%貼壁的HEK293A細胞。收集完全病變培養(yǎng)孔中的細胞及培養(yǎng)液,-20℃和37℃反復凍融3次,上清加入293A細胞中繼續(xù)感染擴增腺病毒。經(jīng)多輪感染后獲得高滴度的Ad-shRNA-SIK2重組腺病毒和空載體病毒。

1.2.3 重組腺病毒純化、濃縮和滴度測定 按照試劑盒說明書操作,采用特殊的純化膜從腺病毒粗提取液中特異性吸附病毒顆粒進行純化和濃縮。病毒的滴度通過測定游離病毒顆粒的吸光度值進行確定(在260 nm處的1個吸光度值相當于1012病毒顆粒/ml）。提純后的重組腺病毒濃度可達到0.5×1012病毒顆粒/ml。

1.2.4 3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化 3T3-L1細胞按照常規(guī)的貼壁細胞方法培養(yǎng)。在細胞狀態(tài)良好時,傳代分瓶(1×105/ml）,細胞接觸抑制兩天后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含0.5 mM 3-異丁基-1甲基黃呤、10 μ g/ml胰島素 、0.25 μ M 地塞米松）培養(yǎng)兩天,接著換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含10μ g/ml胰島素）培養(yǎng)兩天,最后改為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng),每兩天換液,直至90%的細胞為成熟的脂肪細胞。

1.2.5 Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體轉(zhuǎn)染成熟的3T3-L1,Real-time RT-PCR檢測脂肪細胞中SIK2 mRNA的表達 脂肪細胞分別用 2.5×1010、1×1011、2.5×1011純化病毒顆粒/ml Ad-shRNA-SIK2腺病毒和空載體病毒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細胞,并以空載體病毒作為陰性對照,更換培養(yǎng)液后在37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,收集細胞,提取細胞總RNA,Real-time RT-PCR檢測脂肪細胞中SIK2 mRNA的表達。挑選最佳感染病毒濃度。

1.2.6 Western blot分析沉默效果 pAd-shRNA-SIK2重組病毒和對照空載體腺病毒分別感染3T3-L1分化脂肪細胞48 h后,收集細胞用PBS洗滌3次,提取總蛋白,按《分子克隆實驗操作指南》取等量蛋白20 g經(jīng)十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE）電泳分離蛋白,然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,一抗分別為SIK2兔抗鼠多克隆抗體和兔抗鼠β-actin多克隆抗體,二抗為HRP標記的山羊抗兔lgG。用化學發(fā)光法顯色蛋白表達水平。

1.2.7 統(tǒng)計分析 用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量資料采用均數(shù)±標準差(ˉx±s）來表示,組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為顯著統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質(zhì)粒的測序結(jié)果送3個穿梭質(zhì)粒測序后,證實所設(shè)計ds oligo已經(jīng)正確插入pENTR/U6載體中,位于人u6啟動子和PolⅢ終止子之間。

2.2 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)導3T3-L1細胞后,RT-PCR篩選最佳穿梭質(zhì)粒:將構(gòu)建好的3個質(zhì)粒轉(zhuǎn)導入脂肪細胞后,第5天用Real-time PCR檢測3T3-L1脂肪細胞SIK2 mRNA的基因表達,結(jié)果以目標基因與GAPDH基因表達的比值表示,結(jié)果顯示SIK2 shRNA-1,2,3均對SIK2有明顯的抑制作用(P＜0.05）,其中SIK2 shRNA-2對 3T3-L1細胞SIK2表達抑制作用最強,抑制率為86%(圖1）。

2.3 不同濃度的Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體轉(zhuǎn)染成熟的3T3-L1細胞后,RT-PCR篩選最佳轉(zhuǎn)染濃度:以空載體為對照,Real-time PCR測量三種濃度的2.5×1010、1×1011、2.5×1011純化腺病毒顆粒/ml轉(zhuǎn)染脂肪細胞后的SIK2mRNA的基因沉默效率。結(jié)果顯示三種濃度純化腺病毒顆粒均對成熟的3T3-L1細胞SIK2 mRNA表達有明顯的抑制作用(P＜0.05）,其中2.5×1011純化腺病毒顆粒/ml的濃度沉默效率最高,達到71%(圖2）。

圖1 pENTR/U6-shRNA-SIK2穿梭質(zhì)粒干擾SIK2 mRNA基因表達效果

圖2 Ad-shRNA-SIK2腺病毒載體干擾SIK2 mRNA基因表達效果

2.4 Western blot檢測3T3-L1脂肪細胞Ad-shRNASIK2腺病毒載體的RNA干擾SIK2蛋白表達效果:用2.5×1011病毒顆粒/ml Ad-SIK2腺病毒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細胞48 h后,收集細胞經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析,可見感染空載體腺病毒的細胞分子量約為120 kD的條帶,而感染pAd-SIK2重組病毒的細胞條帶明顯降低,見圖3。

圖3 Ad-shRNA-SIK2腺病毒干擾SIK2的蛋白表達

3 討論

肥胖已成為嚴重危害人類健康的社會問題。現(xiàn)有大約十億的成年人是超重,其中3億成年人是肥胖。肥胖和超體重是高血壓、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、腦卒中等多種疾病的重要危險因素[3]?？刂品逝?減少機體脂肪聚集可降低心腦血管等疾病的危險性和發(fā)病率。能量代謝失衡是導致肥胖的根本原因。作為細胞能量監(jiān)測器,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK,5'AMP activated protein kinase）系統(tǒng)一直密切監(jiān)視著細胞的能量狀態(tài)。AMPK的活性受AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)。應激反應可通過ATP的產(chǎn)生減少或利用增加,使細胞內(nèi)AMP/ATP的比值增加,從而激活AMPK。激活的AMPK可激發(fā)一系列的反應來恢復細胞內(nèi)的能量平衡。AMPK可啟動分解代謝途徑,如脂肪酸氧化和糖酵解,從而增加ATP的產(chǎn)生,同時關(guān)閉合成代謝途徑,如脂肪酸合成和蛋白合成,減少ATP的消耗[4]。目前AMPK在肌肉和肝臟的能量代謝中的作用有廣泛的研究,有關(guān)AMPK在脂肪組織中的研究較少,作用并不明確。

SIK2是AMPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶,相對特異性地在脂肪組織表達[5]。有文獻報道肥胖或糖尿病老鼠脂肪組織中SIK2的活性升高[6],饑餓時脂肪組織的SIK2表達顯著升高[1],SIK2可能是脂肪組織能量的代謝重要調(diào)節(jié)因子,起著AMPK樣的能量感受器作用。明確SIK2在體內(nèi)脂肪組織內(nèi)的作用和分子機制,有助于對肥胖和II型糖尿病脂代謝紊亂的理解和認識。本實驗采用RNAi技術(shù),以SIK2為靶基因,設(shè)計三對編碼SIK2shRNA的寡核苷酸鏈,定向克隆至 shRNA質(zhì)粒表達載體pENTR/U6-shRNA穿梭質(zhì)粒,在3T3-L1細胞中表達篩選RNA干擾效率最高的一對SIK2 shRNA-2。通過同源重組,在體外構(gòu)建表達SIK2 shRNA的腺病毒表達載體。純化的載體轉(zhuǎn)染到成熟的3T3-L1脂肪細胞系后,在U6啟動子作用下在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA,轉(zhuǎn)錄體自身折疊形成特異的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)shRNA,在細胞內(nèi)產(chǎn)生發(fā)夾狀的siRNA,進而特異性導致SIK2 mRNA降解,長期而有效地沉默了小鼠成熟脂肪細胞3T3-L1的SIK2蛋白的表達。本實驗通過腺病毒介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù),成功轉(zhuǎn)染3T3-L1成熟脂肪細胞系,特異性地干擾SIK2 mRNA表達(71%）,進而導致SIK2蛋白的合成明顯減少。SIK2 shRNA腺病毒表達載體的成功構(gòu)建為進一步觀察SIK2基因在脂肪細胞中的作用和分子機制,研究SIK2與肥胖的關(guān)系提供了實驗基礎(chǔ)。隨著對SIK2的深入研究,必將促進肥胖病脂代謝紊亂的研究發(fā)展,為研究肥胖的基因治療提供新思路。

[1]Du J,Chen Q,Takemori H,Xu H.SIK2 inhibits expression of lipogenic genes in adipocytes[J].Obesity,2008,16(3）:531.

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[3]黃 輝,陳 潔,王景峰,等.EETs下調(diào)在高脂誘導肥胖相關(guān)高血壓中的作用[J].中國病理生理雜志,2008,24(11）:2113.

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