張建剛 宋延波 張 毅 賀 興 馮 飛 晏 勇

重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1)神經(jīng)內(nèi)科 2)腫瘤科 重慶 400016

皮質(zhì)發(fā)育障礙(DCDs)是一種大腦皮質(zhì)發(fā)育異常,包括大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元正常而結(jié)構(gòu)異常的腦畸形。目前DCDs發(fā)生率仍然不清楚,但隨著磁共振影像(MRI)的應(yīng)用,DCDs的診斷率明顯增加。估計25%～40%的難治性或耐藥性小兒癲由DCDs引起[1],且至少75%的DCDs病人患有癲[2]。DCDs的發(fā)生是由正常的皮質(zhì)神經(jīng)元的異位或異常的皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)所造成,而這些異常的神經(jīng)元導(dǎo)致皮質(zhì)的異常網(wǎng)絡(luò)形成。影響胚胎期神經(jīng)元移行的因素很多,如基因突變、射線、冰凍、化學(xué)藥物等。因此國內(nèi)外學(xué)者利用射線照射、液氮冷凍以及化學(xué)藥物甲基氧化偶氮甲醇注射的方法建立神經(jīng)元移行異常的動物模型。一定劑量的射線會造成移行神經(jīng)元的死亡,Hicks等[3]發(fā)現(xiàn)幼稚的、正處于遷移狀態(tài)的神經(jīng)元對射線的損傷敏感度較高。本課題組選擇X射線照射的方法建立神經(jīng)元移行異常的模型,并在前期的工作中通過對皮質(zhì)發(fā)育障礙大鼠模型大腦組織進(jìn)行基因芯片的篩查發(fā)現(xiàn)了一些導(dǎo)致神經(jīng)元遷移紊亂的基因。本實驗對其中的生長抑素受體1進(jìn)一步研究探討皮質(zhì)發(fā)育障礙神經(jīng)元遷移紊亂的機(jī)制及其致癲機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 6只SD孕鼠用于實驗(由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心提供),體質(zhì)量300～350 g。幼鼠出生當(dāng)天計為P0,飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境,自由進(jìn)食。6只孕鼠實驗按需要完全隨機(jī)分成2組,皮質(zhì)發(fā)育障礙組3只孕鼠和3只正常對照組孕鼠各出生30幼鼠,P60時在保持性別比例對等的前提下完全隨機(jī)各選取5只進(jìn)行免疫組化檢測,5只進(jìn)行Western Blot檢測。

1.2 X射線照射誘導(dǎo)的皮質(zhì)發(fā)育障礙模型的建立 將3只孕15 d SD大鼠分別放入長20 cm、寬10 cm、高 10 cm的紙盒中,置于直線加速器治療機(jī)進(jìn)行X射線照射,照射劑量200CGY,劑量率200CGY/min,時間60 s[4]。照射后的孕鼠正常喂養(yǎng)待其分娩。幼鼠在其出生后21 d斷奶。常規(guī)飼養(yǎng)至60 d。

1.3 免疫組化檢測 sstr-1免疫組化采用SABC法。檢測方法：二甲苯浸泡脫蠟,梯度酒精脫水,枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)20 min,3%H2O2滅活內(nèi)源性酶15 min,正常山羊血清封閉抗原30 min,去除血清,加入兔抗sstr-1多克隆抗體(Santa Cruz公司,濃度為1∶200),37℃孵育2 h。根據(jù)SABC試劑盒完成ABC步驟。以上每一步驟之后均用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,p H=7.2～7.6)洗滌3次,每次5 min。DAB顯色后用去離子水洗滌,然后經(jīng)蘇木素復(fù)染,二甲苯透明,最后中性樹膠封片。

1.4 Western Blot檢測 快速斷頭取大鼠海馬,按常規(guī)進(jìn)行組織蛋白質(zhì)提取,運用BCA法測定蛋白質(zhì)的濃度,取約50 μL蛋白質(zhì)用于15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜后,用TBST緩沖液室溫封閉1 h,加入兔抗sstr-1蛋白抗體(1∶200)或兔抗β-actin抗體(1∶2000)(Santa Cruz公司),在4℃下孵育過夜,用 TBST溶液洗膜4次,每次8 min。室溫下相應(yīng)加入羊抗兔IgG(北京中杉1∶2000)抗體孵育2 h,然后采用同法洗膜4次,應(yīng)用增強型化學(xué)發(fā)光試劑(Santa Cruz公司)顯色,最后凝膠成像分析系統(tǒng)攝像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 15.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。描述性數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩獨立樣本均數(shù)間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 皮質(zhì)發(fā)育障礙組大鼠海馬區(qū)sstr-1陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少,染色強度也明顯減弱。特別是在海馬的CA 1區(qū)減少更為明顯。皮質(zhì)發(fā)育障礙組大鼠海馬區(qū)sstr-1的表達(dá)主要集中在神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿。在正常情況下,正常組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿中有一定強度的sstr-1表達(dá)。見圖1。

圖1 sstr-1免疫組化染色 a 正常對照組大鼠海馬中高表達(dá)(4×10);b 皮質(zhì)發(fā)育障礙組大鼠海馬中低表達(dá)(4×10);c 正常對照組大鼠海馬免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞,陽性表達(dá)部位主要在細(xì)胞核(40×10);d 皮質(zhì)發(fā)育障礙組大鼠海馬免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞,陽性表達(dá)部位主要在細(xì)胞核(40×10);箭頭：陽性細(xì)胞

圖2 皮質(zhì)發(fā)育障礙組和正常對照組大鼠海馬sstr-1 Western Blot結(jié)果分析 A 對照組泳道為 1、3、4、7、8;皮質(zhì)發(fā)育障礙組泳道為 2、5、6、9、10;sstr-1 條帶在 65 k D,β-actin條帶在42 k D;β-actin作為陽性參照 B DCDs組 sstr-1平均OD值顯著低于對照組(*P＜0.05)

2.2 Western Blot 免疫印跡檢測結(jié)果顯示膜上約65 kD的位置上可見黑色陽性雜交帶,即為sstr-1蛋白表達(dá),從雜交信號的強度看,皮質(zhì)發(fā)育障礙大鼠海馬組織標(biāo)本中的sstr-1蛋白表達(dá)明顯弱于對照組;β-actin的陽性雜交條帶出現(xiàn)在42 kD的位置。使用Quantity one采圖分析軟件得出每個條帶的平均OD值(每個目的條帶與相應(yīng)的β-actin OD值的比值),DCDs組的平均OD值為0.59±0.15,對照組的平均OD值為 1.02±0.14(P＜0.05)。見圖2。

3 討論

sst家族分為5個亞型,sstr-1即生長抑素受體1,它的基因定位于6q23。在海馬區(qū)主要分布在CA 1區(qū)、齒狀回、內(nèi)嗅皮質(zhì)。功能較為復(fù)雜：(1)sstr-1與神經(jīng)肽Y一起作用對細(xì)胞的活動起啟動作用[5-6]。原位雜交法發(fā)現(xiàn)sstr-1和神經(jīng)肽Y在大鼠下丘腦內(nèi)側(cè)基底部的細(xì)胞中共表達(dá)。也有關(guān)于sstr-1與生長激素釋放激素在漏斗核細(xì)胞共表達(dá)的報道[7]。其他組織關(guān)于sstr-1的研究也很多。Watt等[8]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞有sstr-1和sstr-5表達(dá),而且表達(dá)量與腫瘤體積成正比,與瘤細(xì)胞分化程度成反比。提示sstr-1可能對于低分化細(xì)胞的增值、分化等有一定作用。生長發(fā)育的神經(jīng)元中的sstr-1可能有相似的作用。(2)有人采用基因敲除技術(shù)觀察sstr-1(-/-)小鼠模型胰島素分泌以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定情況意外發(fā)現(xiàn)sstr-1(-/-)模型鼠除了表現(xiàn)內(nèi)環(huán)境的紊亂外,還明顯表現(xiàn)出來軀體生長發(fā)育遲滯[9]。

我們前期的基因芯片掃描發(fā)現(xiàn)sstr-1基因表達(dá)下調(diào),本實驗的前期結(jié)果顯示皮質(zhì)發(fā)育障礙組大腦外形與正常組相比明顯變小,體積縮小。HE染色顯示皮質(zhì)發(fā)育障礙大鼠海馬區(qū)特別是CA1出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元遷移紊亂。說明X射線誘導(dǎo)的皮質(zhì)發(fā)育障礙大鼠模型是能夠很好地模擬人的皮質(zhì)發(fā)育障礙。在免疫組化中皮質(zhì)發(fā)育障礙大鼠模型海馬區(qū)sstr-1的表達(dá)減少,特別是在海馬的CA1區(qū)顯著減少,Western Blot蛋白定量進(jìn)一步顯示在皮質(zhì)發(fā)育障礙大鼠模型的海馬區(qū)sstr-1表達(dá)下調(diào)。本實驗?zāi)Ｐ捅憩F(xiàn)的大腦發(fā)育障礙及癲易感性的特點,sstr-1下調(diào)很可能起了重要作用。

[1]Kuzniecky RI,Jackson GD.Magnetic resonance in epilepsy[J].New York ：Raven Press,1995 ：183-202.

[2]Leventer RJ,Phelan EM,Coleman LT,et al.Clinical and imaging features of cortical malformations in childhood[J].Neurology,1999,53：715-722.

[3]Galileo D,Majors J,Horwitz A,et al.Retrovirally introduced antisense integrin RNA inhibits neuroblast migration in vivo[J].Neuron,1992,9：1 117-1 131.

[4]Nakanishi K,Watanabe K,Kawabata M,et al.Altered synaptic activities in cultures of neocortical neurons from p renatally X-irradiated rats[J].Neurosci Lett,2004,355(1/2)：61-64.

[5]Okazaki Y,Furuno M,Kasukawa T,et al.Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs[J].Nature,2002,420(6915)：563-573.

[6]Fodor M,van Elk EJ,Huizinga CT,et al.NPY neurons exp ress somatostatin receptor subtype 1 in the arcuate nucleus[J].Neuroreport,2005,16(1)：29-32.

[7]Tannenbaum GS,Zhang WH,Lapointe M,et al.Growth hormone-releasing hormone neurons in thearcuate nucleus exp ress both sst1 and sst2 somatostatin recep tor genes[J].Endocrinology,1998,139：1 450-1 453.

[8]Watt HL,Kumar U.Colocalization of somatostatin recep tors and epidermal growth factor receptors in breast cancer cells[J].Cancer Cell Int,2006,6(1)：5.

[9]Wang XP,Norman M,Yang J,et al.Alterations in glucose homeostasis in sstr-1 gene-ablated mice[J].Mol Cell Endocrinol,2006,247(1/2)：82-90.

[10]Cammalleri M,Martini D,Timperio AM,et al.Functional effectsof somatostatin receptor 1 activation on synaptic transmission in the mouse hippocampus[J].J Neurochem,2009,111(6)：1 466-1 477.

[11]Cammalleri M,Cervia D,Langenegger D,et al.Somatostatin receptorsdifferentially affect spontaneous epileptiform activity in mouse hippocampal slices[J]. Eur J Neurosci,2004,20(10)：2 711-2 721.