馮定遠

在動物飼糧中添加植酸酶可減少環(huán)境污染，降低飼養(yǎng)成本，促進動物生長發(fā)育。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，商業(yè)植酸酶制劑逐漸得到了廣大用戶的認可。然而，由于現(xiàn)代飼料加工過程中工藝環(huán)節(jié)的復(fù)雜性，植酸酶制劑的應(yīng)用效果與酶制劑本身的抗逆性密切相關(guān)。不同來源植酸酶的抗逆性可能存在較大差異。在生產(chǎn)實際中應(yīng)選擇耐熱性好、最適pH值范圍廣、能被胃腸道消化酶作用的植酸酶制劑，同時還應(yīng)注意礦物元素對其酶活的影響。

1 植酸酶的耐熱性

飼料加工過程中有一個高溫調(diào)質(zhì)過程，溫度一般在75～80℃，有時溫度高達85～90℃，在膨化飼料制作過程中甚至達到120℃或者更高。由于酶制劑本質(zhì)大多為蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)易受溫度的影響使分子內(nèi)的振動增強，從而破壞維持空間構(gòu)象的次級鍵，有時還會使某些蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂并發(fā)生二硫鍵交換反應(yīng)，從而產(chǎn)生熱變性；而且隨著溫度的升高，發(fā)生熱變性的植酸酶蛋白逐漸增多，植酸酶的活性也隨著迅速下降（汪玉松等，2005）。我們一般認為，酶制劑在制?；蚺蚧瘻囟认峦ǔ０l(fā)生的是不可逆活性損失。然而，Pasamontes等（1997）認為，植酸酶對溫度的耐受性可能與其發(fā)生熱變性后的構(gòu)象恢復(fù)有關(guān)，高溫調(diào)質(zhì)時植酸酶的二級構(gòu)象發(fā)生改變，冷卻后這種改變的二級構(gòu)象可以部分回復(fù)到適宜活性的構(gòu)象，從而保持一定的酶活性，這也是目前有些耐高溫植酸酶在高溫處理之后仍然有較高的活性殘留的原因之一。

溫度對酶制劑影響的研究報道較多（李衛(wèi)芬等，2001a；馬合勤，2002；于旭華，2004；楊彬，2004；鄭濤，2005；陳惠等，2005；左建軍等，2006；冒高偉，2006；李健等，2006；王楓等，2007；王嚴等，2007），其研究結(jié)果都表明溫度會對外源酶制劑產(chǎn)生影響，經(jīng)高溫處理后外源酶的活性會受到不同程度的損失。Markus Wyss等（1998）報道，煙曲霉和黑曲霉植酸酶在50～70℃時就會發(fā)生熱變性，pH值2.5的酸性黑曲霉植酸酶在80℃以上高溫時會產(chǎn)生不可逆的活性損失作用。尹清強等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)60℃調(diào)質(zhì)制粒后與未經(jīng)調(diào)質(zhì)的粉料相比只有48%～58%的酶活殘留，而加熱到80℃時僅有2%～15%的酶活存留，隨著制粒溫度的升高（60～80℃），植酸酶的酶活力將逐漸下降（P＜0.01）。趙春等（2007）研究結(jié)果表明，添加有植酸酶并經(jīng)75℃制粒后飼糧的飼喂效果要比經(jīng)80、85℃制粒后的飼料飼喂效果好（P＜0.05）。本課題組研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫調(diào)質(zhì)后植酸酶活性顯著下降，調(diào)質(zhì)溫度為75、85和95℃時飼糧中耐熱植酸酶活性下降幅度分別為10.75%、25.65%和30.53%（陳旭，2008）。

生產(chǎn)中為了獲得較高的酶活，可選擇增加酶添加量及添加耐溫物質(zhì)（脂肪等）以避免因酶高溫失活而影響動物生產(chǎn)。此外，還有兩種解決植酸酶熱變性的常用方法：第一種辦法是采用后噴涂技術(shù)添加植酸酶，也就是于飼料原料經(jīng)調(diào)質(zhì)制粒冷卻后，將液態(tài)的植酸酶制劑均勻噴灑到顆粒飼料表面；后噴涂法避開了高溫調(diào)質(zhì)對植酸酶的活性損傷作用，但是它需要有專門的后噴涂設(shè)備。另外一種主要的解決辦法是提高植酸酶的耐熱性能。付石軍等（2007）綜述了改善植酸酶耐熱性的方法，指出可以采用自然選擇法、蛋白質(zhì)工程法、化學(xué)修飾法以及包括添加酶穩(wěn)定劑和制備包被型顆粒在內(nèi)的生產(chǎn)工藝改善這四種主要方法來提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。本課題組把從無花果曲霉中提取的能夠耐受高溫的植酸酶蛋白基因?qū)氘叧嘟湍钢校ㄟ^畢赤酵母的表達，并采用液態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)而獲得耐熱植酸酶。試驗結(jié)果顯示，在經(jīng)75、85、95℃調(diào)質(zhì)后這種耐熱植酸酶的活性有明顯下降（P＜0.01），但經(jīng)各溫度調(diào)質(zhì)后飼料中耐熱植酸酶仍能分別保持89.25%、74.35%、69.47%的相對酶活性（陳旭，2008）。王國坤等（2006）和曲麗君（2007）對泡盛曲霉植酸酶進行了研究；崔富昌（2006）對米曲霉植酸酶進行了研究；陳艷（2004）也對煙曲霉植酸酶進行了研究，他們試驗中所選用植酸酶經(jīng)90℃處理后僅有40%左右殘存酶活性。相比之下，本課題組所采用的耐熱植酸酶表現(xiàn)出了較好的耐熱性能，即使經(jīng)95℃處理后仍能保持69%以上的酶活性，在普通制粒過程中能保持較高的酶活力，但為達到最佳添加效果則還需考慮其調(diào)質(zhì)時的損失。在較高制粒溫度或膨化溫度條件下需要考慮適量添加耐溫物質(zhì)以進一步提高其耐熱性。

能在現(xiàn)代飼料工業(yè)中得到推廣并廣泛利用的植酸酶必須具有良好的熱穩(wěn)定性。但是，與此同時，我們要注意避免盲目追求耐高溫的特性，因為飼料用植酸酶不僅要求能在高溫加工之后有較高的活性殘留，更為關(guān)鍵的是其在常溫下（尤其是在動物機體胃腸道內(nèi)溫度下）也需具有較高的酶活性，否則我們?yōu)榱四透邷囟_發(fā)耐高溫產(chǎn)品，這就偏離了飼料酶制劑產(chǎn)品設(shè)計和開發(fā)的主線了。這幾年曾經(jīng)出現(xiàn)市場上盲目追求酶制劑的耐高溫性的現(xiàn)象，結(jié)果出現(xiàn)有些植酸酶雖然能耐受高溫的調(diào)質(zhì)作用，但是在常溫下的酶活性卻很低，使其在實際應(yīng)用中受到一定的限制。陳艷等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，煙曲霉植酸酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，65℃時酶活力保持在80%以上，至90℃活力為46.2%，但在37℃活性較低，僅為25.4%。動物胃腸道內(nèi)的溫度一般都在37～41℃，這種煙曲霉植酸酶在37℃時的酶活性只有最適反應(yīng)溫度下的25.4%，因此在實際生產(chǎn)中會對應(yīng)用效果產(chǎn)生一定的影響。

2 pH值對植酸酶活性的影響

飼料生產(chǎn)中所用的植酸酶主要在動物體胃腸道中發(fā)揮作用，在其分解植酸和植酸鹽的過程中會受到機體胃腸道內(nèi)pH值環(huán)境的影響，在不同的pH值環(huán)境中植酸酶表現(xiàn)出不同的酶活性。王楓等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，在pH值為4.5～6.0的范圍內(nèi)植酸酶有80%以上的活性，在pH值為5.5處具有最高活性；高于或低于5.5時都會影響植酸酶的活性，在pH值3.5、3.0、2.0處的相對酶活性依次為44.44%、24.05%、3.31%，在pH值6.5、7.0處分別具有49.72%、22.82%的相對酶活，當pH值大于7.5時，僅剩余不足10%的相對酶活性。課題組（2008）對無花果曲霉源植酸酶的酶學(xué)特性研究表明，體外條件下，將酶促反應(yīng)的pH值分別控制在2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時，該植酸酶在pH值2.0～7.0之間pH值5.5處有一個高峰點，pH值在5.0的相對酶活性與pH值5.5處相接近，為99.25%；pH值由2.0上升至2.5時，相對酶活性迅速由12.25%增至45.72%；在pH值2.5～5.0區(qū)間內(nèi)，相對酶活性隨pH值的升高呈較緩的升高；在pH值5.5～7.0區(qū)間內(nèi)，相對酶活性則隨pH值的升高而急劇下降，由pH值5.5時的相對酶活100%迅速下降為pH值7.0時的1.85%；pH值為3.5～6.0時，耐熱植酸酶的相對酶活性都保持在70%以上，pH值2.5～6.5時相對酶活性都在40%以上，可見此植酸酶可在相對較寬的pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用；當pH值＜2.5和pH值＞6.5時，耐熱植酸酶的活性都很低，在中性環(huán)境中幾乎沒有活性（陳旭，2008）。而之前我們對芽孢桿菌來源植酸酶的研究時發(fā)現(xiàn)，在pH值為4.5時，該植酸酶具有最高酶活，pH值從2.0～3.0，酶活急速升高，從pH值3.0到pH值4.5相對酶學(xué)活性逐步上升到最高點；當pH值在4.5～6.0時，相對酶活緩慢降低；當pH值在4.0～6.0之間時，相對酶活保持在80%以上，其中pH值在4.5～5.5之間時，相對酶活都在95%以上（李春文，2007）。

這可能是因為pH值影響酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)和催化活性，當環(huán)境pH值和植酸酶的最適pH值相差過大時，維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的次級鍵遭到破壞，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)改變，甚至是活性中心疏水內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生變化，致使酶活性減弱或喪失（劉志偉，2007、2008）。另一方面，從植酸酶催化反應(yīng)機理上講，環(huán)境pH值直接影響植酸酶活性位點氨基酸殘基側(cè)鏈的解離狀態(tài)（劉志偉等，2008）。而蔡琨等（2004）認為，pH值對酶活性的影響并非是由于酸、堿作用了整個酶分子從而影響整個酶分子的解離狀態(tài)，而是由于它們改變了酶的活性中心或與之有關(guān)的基團的解離狀態(tài)，從而使酶的活性狀態(tài)發(fā)生改變。

對于不同來源的植酸酶，植酸酶的最適pH值和發(fā)揮作用的最適pH值范圍也不同。許堯興等（1999）研究發(fā)現(xiàn)，來源于無花果曲霉A.ficuum CN-92的植酸酶最適反應(yīng)pH值為5.5，適宜范圍為5.0～6.6，pH值高于6.0時酶解速度驟降。陳艷等（2004）報道，煙曲霉植酸酶的最適反應(yīng)pH值為5.0，適宜范圍為4.0～5.8，pH值高于7.0，酶解速度驟降至相對酶活不足10%。王國坤等（2006）和曲麗君（2007）研究結(jié)果也表明，泡盛曲霉植酸酶最高活性分別在pH值為2.5和5.5時（在pH值2.5時相對酶活力為pH值5.5條件下的90%），在pH值2.0～6.0范圍內(nèi)都有較強的活性（＞60%），因此能很好地適應(yīng)畜禽動物的消化道環(huán)境（唾液腺pH值5.0；胃pH值2.0～4.0；小腸上部pH值4.0～6.0），降解消化系統(tǒng)中的植酸（鹽）。王嚴等（2007）報道，重組植酸酶（黑曲霉WY-6植酸酶）具有很寬的pH值適用范圍，在pH值2.5～6.5范圍內(nèi)均能保持較高的酶活力。從這些研究結(jié)果可看出，植酸酶發(fā)揮作用的最適pH值范圍大多在酸性環(huán)境中有比較寬的pH值范圍內(nèi)。本課題組試驗所用耐熱植酸酶在不同pH值環(huán)境中表現(xiàn)出不同的酶活性。

也有許多學(xué)者對其是否適合在機體胃腸道內(nèi)發(fā)揮作用及發(fā)揮作用的主要部位進行了研究。史凱來等（2000）報道，在雞嗉囊pH值（pH值5.0～6.0）環(huán)境下，植酸酶的相對標準酶活為100%，可以充分發(fā)揮作用。Taewan等（2006）通過改變黑曲霉植酸酶PhyA上的pH值相關(guān)位點獲得了突變體E228K，試驗證明，該突變體表達所得的植酸酶能適應(yīng)胃中pH值，在機體胃中發(fā)揮作用，提高了其作為動物飼料添加劑的有效性。劉志偉（2007）研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉植酸酶在pH值2.5～7.5（肉仔雞消化道）酶活性可保持在30%以上，其中在pH值4.5（嗉囊）的條件下活性最高，其次是pH值2.5、pH值3.0及pH值3.5（胃部），在pH值6.0和pH值7.0（小腸）最低，據(jù)此判定植酸酶在肉仔雞的消化道內(nèi)的適宜作用位點為嗉囊、十二指腸和空腸前段。程萬蓮等（2007）研究結(jié)果與上述報道有所不同，其研究結(jié)果表明，42日齡和70日齡海蘭褐蛋雞肌胃的pH值在2.5～3.4，超過了植酸酶的活性范圍，因此在肌胃中沒能檢測到植酸酶活性，而小腸食糜的pH值為6.0～7.0，能夠檢測到植酸酶活性。從上述研究結(jié)果可以看出，一般在pH值4.5～5.5左右植酸酶具有最高的酶活性。

此外，近年來，為了最大程度利用植酸酶在動物體內(nèi)發(fā)揮酶解作用，開發(fā)具有較寬的適宜作用pH值范圍的植酸酶是一個重要的發(fā)展方向。其中，最主要的手段是通過基因工程技術(shù)、修飾改良等技術(shù)開發(fā)在不同pH值條件下具有兩個或者多個活性高峰的植酸酶。李健等（2006）選擇的植酸酶適宜pH值范圍內(nèi)卻有兩個酶活高峰點，即一個在pH值2.5處，一個在pH值5.5處。本課題組試驗所用耐熱植酸酶適宜作用pH值范圍內(nèi)只有一個高峰點，最適作用pH值為5.5，隨著pH值由2.0上升至5.5，耐熱植酸酶的酶活性逐漸上升，當pH值高于5.5后植酸酶的活性迅速下降（陳旭，2007），這與王強（2006）研究的植酸酶特點相一致。

從pH值對植酸酶的酶活影響程度考慮，忽略其它因素對植酸酶活性的影響，可以看出大部分植酸酶能適應(yīng)畜禽胃腸道中pH值，可以較大程度地發(fā)揮水解植酸的作用。

3 礦物元素對植酸酶活性的影響

植酸酶添加到飼料中，進入機體胃腸道后，動物機體本身和飼料的各種離子都將對其活性產(chǎn)生影響。很多學(xué)者對不同來源的植酸酶進行了研究（許堯興等，1999；馬合勤，2002；鄭濤，2005；潘力等，2006；陳旭等，2008），他們的研究結(jié)果均表明，不同濃度、不同種類的金屬離子會對植酸酶活性產(chǎn)生不同程度的影響。

許堯興等（1999）研究表明，F(xiàn)e2+對植酸酶有抑制作用，而鄭濤（2005）研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+對植酸酶有激活作用。Fe2+除在低濃度（5 μmol/l）時有酶活抑制作用外，在其它濃度中都表現(xiàn)出明顯的酶活促進作用（陳旭，2008）。另外，本課題組試驗結(jié)果與許堯興等（1999）、王國坤等（2006）和曲麗君（2007）結(jié)果基本一致，不同的是本課題組試驗發(fā)現(xiàn)，中高濃度（10、20、40 μmol/l）Fe2+對植酸酶活性有促進作用。雖然兩試驗所采用的植酸酶均來自于無花果曲霉屬，但所用Fe2+濃度不同，因此，該試驗結(jié)果的差異可能是由于植酸酶結(jié)構(gòu)的差異或金屬離子濃度的不同所引起的。

Liu等（2005）和張政軍等（2006）對堿式氯化銅（TBCC）和硫酸銅對植酸酶存留率的影響進行了研究，試驗結(jié)果表明，在提高植酸酶儲存穩(wěn)定性方面，添加TBCC比添加硫酸銅具有更好的效果。但我們的研究發(fā)現(xiàn)，雖然低濃度Cu2+對酶活的抑制作用不明顯（P＞0.05），但高濃度（40 μmol/l）時效果顯著（0.01＜P＜0.05）（陳旭，2008）。在我們的試驗中，中高濃度（10、20、40 μmol/l）Zn2+對耐熱植酸酶酶活均有顯著的抑制作用（陳旭，2008）。這可能是由于Zn2+和Cu2+與酶促反應(yīng)的植酸鈉形成了復(fù)合物，降低了底物的有效濃度，從而使植酸酶活性受抑制。何為等（2004）也認為，金屬離子對酶活性的抑制作用可能是因為這些金屬離子如Cu2+可能影響了酶分子中巰基的還原狀態(tài)，使之氧化，從而改變酶的構(gòu)象，使酶失活。

本課題組研究還發(fā)現(xiàn)，Ca2+、Mn2+和高濃度（40 μmol/l）的Mg2+有顯著的酶活促進作用（陳旭，2008）；這可能是因為Ca2+、Mg2+、Mn2+是該耐熱植酸酶的活性輔助因子，影響酶與底物的結(jié)合及解離狀態(tài)，達到一定濃度時有酶活促進作用（何為等，2004）。此外，Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+6種離子的混合體有顯著抑制植酸酶活性的作用。

本課題組上述試驗結(jié)果與陳艷等（2004）和王嚴（2007）研究結(jié)果基本相同。但與王國坤等（2006）和曲麗君（2007）的報道結(jié)果相反，他們的研究結(jié)果表明，Ca2+、Mg2+、Mn2+對植酸酶活性有輕微的抑制作用，F(xiàn)e2+、Zn2+對酶促反應(yīng)有顯著的抑制作用。出現(xiàn)這種差異的原因之一是由于所添加金屬離子濃度不同，本課題組試驗所用Ca2+濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/l，金屬離子Mg2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+都各為5、10、20、40 μmol/l，而王國坤等（2006）和曲麗君（2007）試驗中所用各離子的濃度均為1 mmol/l；另外一個原因是由于植酸酶來源不同，本課題組試驗所用植酸酶為從無花果曲霉中提取的耐高溫植酸酶基因于畢赤酵母中表達而得，而王國坤等（2006）和曲麗君（2007）試驗所用均為源于泡盛曲霉的植酸酶。

從應(yīng)用學(xué)的角度來看，動物飼料和消化代謝過程中礦物元素都是不可或缺的，這是酶制劑應(yīng)用中潛在的問題。在實際生產(chǎn)中，應(yīng)選擇礦物元素抑制作用小的植酸酶制劑，同時減少不必要礦物元素的添加，尤其是對植酸酶制劑酶活有抑制作用的礦物元素。

4 植酸酶對胃腸道消化酶的耐受性

外源酶制劑一般由微生物發(fā)酵而得，其本質(zhì)是具有催化活性的蛋白質(zhì)，因此當外源酶制劑進入畜禽消化道后，其作為蛋白質(zhì)需要經(jīng)受機體胃腸道內(nèi)內(nèi)源性蛋白酶（如胃蛋白酶和胰蛋白酶等）的作用。所添加的外源酶制劑在動物機體內(nèi)是否能耐受動物機體內(nèi)源消化酶的消化分解，能否保持自身的酶活性，這是外源酶制劑在實際應(yīng)用過程中必須解決的問題。沈水寶（2002）研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶不能耐受胃蛋白酶的作用，酸性蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶對胃蛋白酶的耐受性較好。于旭華（2004）研究發(fā)現(xiàn)，分別來自細菌和真菌的兩種木聚糖酶經(jīng)胃蛋白酶處理后相對酶活性迅速下降，酶活損失達70%以上，但是這兩種木聚糖酶對胰蛋白酶的耐受性較好，經(jīng)胰蛋白酶處理后酶活性存留都在80%以上。

近年來，關(guān)于植酸酶對胃腸道消化酶耐受性的研究報道逐漸增多，但多數(shù)集中于對胃蛋白酶的耐受性研究。研究結(jié)果顯示，植酸酶對胃蛋白酶有不同程度的耐受性，胰蛋白酶對植酸酶的酶活抑制作用比胃蛋白酶大。王銀東等（2006）試驗結(jié)果表明，植酸酶經(jīng)不同濃度胃蛋白酶作用后均能保持酶活性不變，表現(xiàn)出對胃蛋白酶極好的耐受性。王嚴等（2007）對重組黑曲霉WY-6植酸酶的研究也發(fā)現(xiàn)，植酸酶對胃蛋白酶的抗性較高，加入高濃度胃蛋白酶后仍能保持70.9%的相對酶活性。張鐵鷹等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶活性在pH值3.0環(huán)境中較為穩(wěn)定，相對酶活性保持在85%以上，當肉仔雞按照5.86 mg/ml水平添加胃蛋白酶，植酸酶的相對酶活性下降至65%；植酸酶在pH值6.0環(huán)境中相對酶活性保持在60%～70%，當肉仔雞按照8.4 mg/ml水平添加胰蛋白酶，植酸酶的相對酶活性急劇降至30%左右。該試驗結(jié)果表明，植酸酶不能耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶，胰蛋白酶對植酸酶活性的抑制作用要比胃蛋白酶強。本課題組試驗研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度的胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，耐熱植酸酶的相對酶活性均顯著降低（P＜0.01），經(jīng)不同濃度胃蛋白酶處理后，無花果曲霉源植酸酶的相對酶活性幾乎沒有變化，維持在83%左右，但隨著胰蛋白酶添加量的加大，耐熱植酸酶的相對酶活逐級遞減（P＜0.01），由2.5 U/ml胰蛋白酶處理后的75.44%相對酶活性降低至20 U/ml時的60.79%，胰蛋白酶對耐熱植酸酶的活性抑制作用強于胃蛋白酶（陳旭，2008）。

理論上，胃蛋白酶可以切割黑曲霉植酸酶肽段上127個位點，胰蛋白酶對黑曲霉植酸酶肽段有33個切割位點，雖然胃蛋白酶的酶切位點遠多于胰蛋白酶，但是胰蛋白酶對植酸酶的破壞作用要強于胃蛋白酶，可能是因為植酸酶在pH值6.0下的蛋白結(jié)構(gòu)同pH值3.0下相比更有利于蛋白酶的切割（劉志偉，2007）。

5 結(jié)語

不同結(jié)構(gòu)植酸酶制劑的酶學(xué)特異性和抗逆性存在差異，應(yīng)注意溫度、pH值、礦物元素和胃腸道消化酶對植酸酶活性的影響。在選用植酸酶制劑時，應(yīng)根據(jù)實際生產(chǎn)和動物生理特點從上述四個方面評價植酸酶，以選擇酶活較高、穩(wěn)定性較好的植酸酶產(chǎn)品。

[1] 于旭華.真菌性和細菌性木聚糖酶對黃羽肉雞生長性能的影響及其機理研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

[2] 馬合勤.植酸酶基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的純化與性質(zhì)研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2002.

[3] 尹清強，韓彪，王國強，等.不同的處理條件對植酸酶活力的影響[J].飼料工業(yè)，2005，26(5)：41-42.

[4] 王嚴，高曉蓉，蘇喬，等.黑曲霉WY-6植酸酶的表達、純化及性質(zhì)研究[J].生物技術(shù)，2007，17(2)：19-22.

[5] 王國坤，高曉蓉，安利佳.一種耐熱性植酸酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12)：33-36.

[6] 王楓，韓志忠，董宏偉，等.植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].淡水漁業(yè)，2007，37(5)：23-25.

[7] 王銀東，廖玉蘭，吳世林.胃蛋白酶和酸度變化對植酸酶酶活的影響[C].動物營養(yǎng)與飼料研究——第五屆全國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集//馮定遠主編.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006：212.

[8] 王強.耐熱植酸酶在斷奶仔豬玉米－豆粕型飼糧中的應(yīng)用研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

[9] 付石軍，孫建義.改善植酸酶熱穩(wěn)定性的策略[J].中國飼料，2007(14)：26-29.

[10] 史凱來，王秀坤，劉偉，等.pH值對植酸酶酶活的影響及其在豬、雞消化道中的分析[J].飼料研究，2000(7)：8-9.

[11] 左建軍.非常規(guī)植物飼料鈣和磷真消化率及預(yù)測模型研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,2005.

[12] 左建軍，林志杰，董澤敏,等.植酸酶耐熱性實驗室評價方法的研究[C].動物營養(yǎng)與飼料研究——第五屆全國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集//馮定遠主編.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006:220.

[13] 劉志偉，張鐵鷹，黃玉亭,等.影響植酸酶在畜禽消化道內(nèi)作用效果的研究進展[J].飼料工業(yè)，2008,29(6)：11-15.

[14] 劉志偉.植酸酶在肉仔雞消化道內(nèi)適宜作用部位的研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007.

[15] 曲麗君.泡盛曲霉植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].微生物學(xué)雜志，2007,27(2)：53-56.

[16] 許堯興，許少春，李孝輝，等.CN-92植酸酶的酶學(xué)特性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，11(1)：29-32.

[17] 何為，詹懷宇.木聚糖酶酶活影響因素的研究[J].中國造紙學(xué)報，2004，19(1)：163-166.

[18] 張政軍，呂林，羅緒剛，等.堿式氯化銅對平養(yǎng)肉雞生長性能、飼糧中維生素E和植酸酶穩(wěn)定性的影響[C].飼料營養(yǎng)研究進展//王恬主編.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006：148-155.

[19] 張鐵鷹，劉志偉，孫杰.肉仔雞消化道內(nèi)pH和蛋白酶對植酸酶活性的影響[C].動物營養(yǎng)與飼料研究——第五屆全國飼料營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集//馮定遠主編.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006:94.

[20] 李衛(wèi)芬，孫建義，顧賽紅.里氏木酶β-葡聚糖酶穩(wěn)定性研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001b,23(2)：97-99.

[21] 李衛(wèi)芬，孫建義，鮑康.金屬離子對飼用酶制劑活性的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999,11(2)：96-98.

[22] 李衛(wèi)芬，孫建義.木聚糖酶的特性研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2001a,27(1)：103-106.

[23] 李春文.中性和酸性植酸酶對植物性飼料磷和鈣體外透析率的影響[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文，2007.

[24] 李健，彭遠義.畢赤酵母Mut＋和MutS重組子表達植酸酶基因及其表達物的酶學(xué)性質(zhì)比較[J].生物技術(shù)通報，2006,3：58-62.

[25] 沈水寶.外源酶對仔豬消化系統(tǒng)發(fā)育及內(nèi)源酶活性的影響[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2002.

[26] 汪玉松，鄒思湘，張玉靜.現(xiàn)代動物生物化學(xué)[M].第三版.北京：高等教育出版社，2005：77-81.

[27] 陳旭.耐熱植酸酶對肉鴨生長性能及養(yǎng)分代謝利用的影響[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2008.

[28] 陳艷，孫建義，付亮劍，等.煙曲霉植酸酶的酶學(xué)特性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004，16(2)：59-62.

[29] 陳惠，王紅寧，楊婉身，等.F43Y及I354M,L358F定點突變對植酸酶熱穩(wěn)定性及酶活性的改善[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2005，21(4)：516-520.

[30] 楊彬.纖維素酶在黃羽肉雞小麥型日糧中的應(yīng)用研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2004.

[31] 鄭濤.植酸酶的特性及其在羅非魚飼料中應(yīng)用的研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

[32] 趙春，朱忠珂，李勤凡，等.制粒溫度對飼喂含植酸酶日糧肉仔雞生長性能及鈣磷利用的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007c，16(4)：47-51.

[33] 冒高偉.α-半乳糖苷酶在斷奶仔豬玉米-豆粕型日糧中的應(yīng)用研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

[34] 崔富昌.米曲霉植酸酶的分離純化、性質(zhì)研究及其基因的克隆[D].山東大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

[35] 黃燕華.不同來源纖維素酶在肉鵝高纖維日糧中的應(yīng)用及其作用機理的研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

[36] 程萬蓮，林東康，高素敏.日糧、食糜中植酸酶活性的測定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34(3)：9-11.

[37] 蔡琨，方云，夏詠梅，等.大豆脂肪氧合酶的提取及影響酶活因素的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004，24(2)：52-56.

[38] 潘力，冉宇舟，王亞琴，等.飼料植酸酶制劑儲存穩(wěn)定性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12)：5-9.

[39] Liu Z,Bryant M M,Roland D A,et al.Layer performance and phytase retention as influenced by copper sulfate pentahydrate and tribasic copper chloride[J].Poultry Research,2005，14:499-505.

[40] Pasamontes L,Monika H,Markus W,et al.Gene cloning,purification,and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus[J].Applied and Environmental Microbiology,1997，63(5):1696-1700.

[41] Taewan K,Edward J M,Jesus M P,et al.Shifting the pH profile of Aspergillus niger PhyA phytase to match the stomach pH enhances its effectiveness as an animal feed additive[J].Applied and Environmental Microbiology,2006，72(6):4397-4403.