郭曉瑞 吳志遠 黃海華 羅少軍 梁杰

2002年，MicroRNAs(miRNAs)的發(fā)現被《Science》雜志評為十大科技突破第一名，近年來，已然成為生命科學研究的重要熱點之一。在動、植物及病毒等生物中發(fā)現了一系列小分子非編碼 RNA(small noncoding RNA)，包括 miRNA，siRNA，piRNA，esiRNA等，它們組成了RNA調控網絡，調控包括細胞增殖、分化和凋亡等一系列生理進程，并與多種人類疾病密切相關［1］。

1 MicroRNA的生物合成及其作用機制

microRNA在基因轉錄后水平調控基因表達，是一類長度為21～24 nt的非編碼小RNA，參與多種生物學信號通路的調節(jié)［2］。成熟的microRNA分子的形成過程包含若干步驟:microRNA基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄合成原始microRNA(pri-microRNA)，pri-microRNA 具有 5'端的帽子、3'端的polyA尾的結構特征;pri-microRNA經過兩次酶的剪切產生成熟的microRNA。動物pri-microRNA第一次剪切在細胞核內，經Dorsha酶切產生大小約為70個核苷酸并形成莖環(huán)結構的microRNA(pre-microRNA);pre-microRNA通過Ran-GTP依賴性核漿轉運子Exportin5從核內轉移至細胞質中。在細胞質中，Dicer酶將pre-microRNA剪切形成一個不完全配對的雙鏈的RNA片段即microRNA和microRNA雙體。這種雙鏈很快被引導進入RNA誘導復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，其中含有Argonaute蛋白，并且成熟的單鏈21～23個核苷酸長度的microRNA分子整合入RNA誘導沉默復合物(RISC)后形成miRNA復合物(miR ISC)，另一條則可能迅速降解。microRNA是一類高度保守的非編碼小RNA，主要通過結合靶基因mRNA的5'UTR、編碼區(qū)或3'UTR而在轉錄后水平上對基因的表達行負調控功能。當microRNA與靶mRNA完全或幾乎完全配對時，則導致mRNA的降解。

目前已知的microRNA主要依賴以下兩種序列互補原則對靶基因起負性調控作用:一種是miRNA與靶基因mRNA完全互補，此種miRNA的結合位點通常在靶基因miRNA的編碼區(qū)域或開放閱讀框中，從而引起靶基因miRNA的降解。另一種是miRNA與靶基因mRNA不完全互補，該種miRNA的結合位點通常在靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)，從而在蛋白質翻譯水平上抑制靶基因mRNA的表達，抑或影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性，為絕大多數哺乳動物中的miRNA發(fā)揮調控作用途徑。一個miRNA可有很多靶基因，而每個基因受多個miRNA調控［3］。生物信息學分析的研究，microRNA在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應等一系列多種程序中發(fā)揮重要作用，提示細胞生命活動中眾多的信號轉導途徑可能由microRNA參與調節(jié)，而每個microRNA亦可能調節(jié)數百個靶基因［4］。

2 MicroRNA與腫瘤性疾病相關性研究

miRNA研究的主要貢獻在揭示了其在腫瘤中的潛在作用，microRNA功能類似于癌基因或抑癌基因，與腫瘤形成密切相關。首先，對線蟲和果蠅研究發(fā)現miRNA的功能是調控細胞增殖與凋亡，提示它們與腫瘤等增殖性疾病密切相關;其次，許多miRNA的基因被證實位于基因組中易發(fā)生在伴隨腫瘤發(fā)生的變異區(qū)域;最后，與正常組織相比，腫瘤性疾病或腫瘤細胞株普遍存在對miRNA的表達調控的異常［5］。研究發(fā)現，編碼調控miRNA的基因發(fā)生突變、缺失以及轉錄后調控失衡、啟動子區(qū)DNA甲基化修飾及結合蛋白異常等引起miRNA 的異常表達［6］。

microRNA表達異常會嚴重影響細胞信號轉導途徑的功效，導致細胞增殖和分化失去控制，最終導致腫瘤的發(fā)生miRNA通過在轉錄后水平調控基因的表達，進而參與了動、植物的組織器官發(fā)育、細胞分化和凋亡等生命活動，其表達異?？蓪е氯缒[瘤等重大疾病。到目前為止，已發(fā)現多個發(fā)揮原癌基因或腫瘤抑制基因作用的miRNA，它們通過調控下游靶基因的轉錄和翻譯參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。不同腫瘤組織microRNA的表達譜存在明顯差異，如microRNA表達的數量和豐度，另一重要方面表現在某些腫瘤中上調表達的microRNA，在其他腫瘤中可能表現為下調表達，提示microRNA在不同組織條件下行使了癌基因或抑癌基因的不同功能。此外，有些microRNA表達具有組織特異性，如miR-122僅在肝臟中表達［7］。而miRNA-21在多種腫瘤中存在表達異常，例如miRNA-21在卵巢癌［8］的腫瘤組織的表達水平則明顯下調，而在白血病［9］、乳腺癌［10］等腫瘤組織中表達上調。說明同一種miRNA在不同的組織中(如腫瘤)所起的作用明顯不同甚至截然相反，即表現為同向或者雙向的差異表達。

腫瘤本質上是一種多基因異常疾病，通過激活一種或多種原癌基因的表達及抑癌基因的突變缺失從而使腫瘤細胞逃避了正常生長調控機制，自主進行增殖和侵襲、出現惡性表型。因此miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后存在著密切的聯(lián)系。

3 血清microRNA:新一代腫瘤標志物

尋找腫瘤標志物并對其進行準確檢測一直都是癌癥研究領域的重點。作為新的切入點，microRNA(miRNA)為癌癥的診斷與治療開辟了新途徑［11］。血清microRNA作為腫瘤診斷和預后的標志物，可應用于早期腫瘤的檢測，且檢測損傷小、靈敏度高、穩(wěn)定性好［12］。miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生的所有重要的信號通路，參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

Chen等［13］應用Solexa技術對健康人和肺癌、直腸癌、糖尿病患者血清中所有小RNA(＜30nt)進行測序證明了血清中確實含有大量的miRNA，不論健康人或患者血清中都存在大量的 miRNA以及 mRNA碎片、rRNA碎片等。Resnick等［14］研究比較了正常人和卵巢上皮癌患者的血清中miRNA表達譜，指出miR-21、miR-92和miR-93是療效評估的潛在生物標記物，在腫瘤患者血清明顯過度表達。Lawrie等［15］通過比較研究彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者和正常人血清中與腫瘤相關的miR-155、miR-210和miR-21水平，發(fā)現患者血清中的這些miRNA水平較正常人高，而且認為高miR-21表達水平與未發(fā)生復發(fā)的存活率有關。由此指出了miRNA可作為區(qū)分DLBCL和其他腫瘤新的非侵入性診斷標志物。Gilad等［16］采用逆轉錄定量 PCR對健康人和結腸直腸癌(CRC)患者血清中miRNA進行檢測評價:與健康人相比，CRC患者血清中有11種miRNA具有明顯變化。從而提出了篩查CRC的新選擇:血清游離miRNA作為血清腫瘤標志物。

總之，通過分析人體正常組織與不同腫瘤組織microRNA表達譜的差異，有望篩選到特異性好、靈敏度高、可作為特定腫瘤分子標志物的microRNA。近來的研究明確表明，血清中含有來自于各種組織器官的游離miRNA，這些血清miRNA表達譜可以作為疾病診斷新的血清標志物，并且其可能比目前所應用的腫瘤和其他疾病的早期診斷方法更為敏感及特異。

4 問題與展望

由于miRNA幾乎參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的每一步過程，所以miRNA在腫瘤的診斷、預后、對化療藥物的療效預測以及治療的新靶點方面均有很好的應用前景。目前腫瘤領域的分子標記主要表現在DNA和RNA水平，但是miRNA因其特殊的穩(wěn)定性及特異性已顯示了其特有的優(yōu)越性。但血清miRNA作為新興的腫瘤分子標志物距離臨床應用還有一定距離。尋找和驗證各種腫瘤的特異性miRNA是我們首先需要解決的問題，如質控和診斷閥值等都有待進一步確定，為建立適合臨床應用的標準化檢測體系建造基礎。除此之外，血清miRNA的功能還需繼續(xù)研究探索。血清miRNA的出現為腫瘤標志物的研究開辟了新的途徑，隨著研究深入，血清miRNA在人類疾病診療中的應用將會取得更多碩果。

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