韓志強(qiáng),李志強(qiáng),張洪濤,陳國福,李 偉,張金友,俞守緒,張 亮

(1.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱 150038;2.黑龍江省農(nóng)墾總局動物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江哈爾濱 150036;3.黑龍江省家畜胚胎移植技術(shù)開發(fā)中心,黑龍江尚志 150600)

胚胎移植技術(shù)主要包括供受體牛的選擇,供體母牛的超數(shù)排卵,供體與受體牛的同期發(fā)情,胚胎的回收,胚胎質(zhì)量的鑒別,胚胎的冷凍保存,胚胎移植,受體牛的妊娠診斷等[1]。超數(shù)排卵是胚胎移植中關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié),通過超數(shù)排卵技術(shù)可以獲得大量整齊、優(yōu)質(zhì)的卵子,使得優(yōu)良后代數(shù)增加幾倍甚至幾十倍,且好的超排效果還要具有高的可移植胚胎的回收率,才可以使得胚胎移植技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)行,加快優(yōu)良品種的擴(kuò)繁[2]。現(xiàn)將胚胎采集方法及技術(shù)要點(diǎn)總結(jié)如下:

1 胚胎收集方法

供體牛超排發(fā)情后的第7 d采用二路沖卵管法進(jìn)行非手術(shù)沖卵。首先將供體牛在保定架保定,用2%的普魯卡因或利多卡因進(jìn)行尾椎硬膜外麻醉,利多卡因劑量為5～10 mL。注射后1～3 min用手輕輕搖動牛尾,當(dāng)牛尾呈“蛇樣擺動”時(shí)即可進(jìn)行操作。清洗陰門,然后用衛(wèi)生紙擦干。在二路采卵管內(nèi)插入不銹鋼內(nèi)芯使之挺直,將挺直的采卵管導(dǎo)入陰道達(dá)陰道穹窿,另一只手在直腸內(nèi)協(xié)助。慢慢將導(dǎo)管插入子宮體,到子宮角內(nèi)5 cm左右,拔出采卵管內(nèi)的內(nèi)芯約2 cm,再使采卵管沿子宮角彎曲方向進(jìn)入子宮角深部。在這一過程中,助手每抽出約2 cm的內(nèi)芯,術(shù)者將采卵管向子宮內(nèi)送入相應(yīng)的長度,直到將采卵管送到子宮角適當(dāng)?shù)奈恢?。采卵管中的一路為“氣路?即通過它向氣球內(nèi)充氣;另一路為“水路”。即向子宮內(nèi)灌注和回收沖卵液。充氣后的氣球可將子宮角固定于子宮角大彎附近。此時(shí),將采卵管內(nèi)的不銹鋼內(nèi)芯全部抽出。首先用 50 mL注射器將20～30 mL沖卵液通過采卵管注入子宮角,再將沖卵液吸入到注射器內(nèi)。沖卵液由20 mL逐漸增加到50 mL,每側(cè)子宮角共用沖卵液500 mL?；厥盏臎_卵液輕輕注入到500 mL的集卵杯把集卵杯的回收液在室溫下(18～22℃)靜置20～30 min,上清液通過過濾皿,最后將過濾皿內(nèi)剩下的30～50 mL回收液搖動后倒入100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)。用PBS液沖洗2～3次,清洗液倒入100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)鏡檢、回收胚胎[3]。

2 影響供體牛胚胎回收率的主要因素

2.1 沖卵液內(nèi)含抗生素

胚胎收集時(shí)由于過敏反應(yīng),子宮直接接觸到抗生素過敏反應(yīng)非?？?此時(shí)子宮角易開始腫脹,采胚時(shí)感觸不到采卵管充氣球的位置或是感覺不清子宮內(nèi)液體的充盈程度,同時(shí)此刻子宮的收縮力降低,液體回流減緩或不回液,由于輸卵管的一端開口于腹腔,進(jìn)液不能回流子宮內(nèi)壓增高致使一定的液體和胚胎經(jīng)輸卵管流入腹腔內(nèi)[4]。

2.2 子宮內(nèi)進(jìn)入氣體

采用注射器推液、抽液的方式進(jìn)行回收胚胎時(shí)不可將空氣帶入子宮角內(nèi),同樣用封閉式回流采集胚胎時(shí)必須排除管內(nèi)空氣,如有空氣進(jìn)入子宮內(nèi)會影響液體的回流,由于空氣的存在使得采卵管回液口接觸不到液體,又采卵管前部沒有回液口致使角尖部液體不能回流,同時(shí)由于氣體的存在,子宮角有限的空間內(nèi)減少了進(jìn)液量,由于氣體使得子宮的腫脹,且氣體在上層很難經(jīng)回液口排除,液體回流不完全或無法回流必將導(dǎo)致胚胎的丟失[5]。

2.3 采卵管堵塞

粘液堵塞進(jìn)回液口是牛只發(fā)情時(shí)分必的粘液沒有完全流出而存留在子宮頸外口,當(dāng)采卵管通過子宮頸口時(shí)粘液會從采卵管的進(jìn)液口進(jìn)到采卵管內(nèi),可能會堵塞幾個(gè)進(jìn)液孔,如粘液的量較大或粘度較高時(shí)采用封閉式進(jìn)回液時(shí)進(jìn)液的力度沖不開堵塞在進(jìn)液口的粘液,采用注射器抽吸法時(shí)小力度也很難把粘液沖開。結(jié)果子宮內(nèi)液體無法回流,壓力過大會使得液體經(jīng)輸卵管前端流出或由于壓力過大而使得子宮內(nèi)壁受傷出血。

2.4 采卵管質(zhì)量

由于采卵管質(zhì)量的差異,管前端的固定球囊在外力作用下移動位置,如在子宮內(nèi)液壓的作用下管后移,氣球向子宮角尖部移動堵塞采卵管回液口。此時(shí)液體無法回流,如減少氣球圍度會使角內(nèi)的部分液體流到子宮體內(nèi)進(jìn)而流入對側(cè)子宮角內(nèi),而影響到對側(cè)角的胚胎收集。

2.5 沖胚液進(jìn)入腹腔

個(gè)體差異有些牛只子宮角和輸卵管之間的通透性非常好,如在進(jìn)液時(shí)不將子宮角尖部捏住或提起會有部分液體經(jīng)輸卵管進(jìn)入腹腔,造成胚胎的不可回收。

2.6 氣球的穩(wěn)定

在采集經(jīng)產(chǎn)牛只時(shí)由于子宮彈力的降低,或是子宮內(nèi)存留一定量的粘液,在固定氣球時(shí)由于打氣量稍有些小或是進(jìn)液時(shí)采胚人員沒有在球囊后固定球囊使得球后移動,如及時(shí)發(fā)現(xiàn)可補(bǔ)一定的氣量繼續(xù)進(jìn)行采胚。如發(fā)現(xiàn)球囊已退回到子宮角分叉部應(yīng)充分將角內(nèi)液體回流后采對側(cè)角再進(jìn)管時(shí)要適當(dāng)淺一些,防止由于另一側(cè)采胚時(shí)的液體流入所造成的影響。

3 提高胚胎回收率的方法

3.1 應(yīng)用抗過敏藥

如發(fā)現(xiàn)供體牛只有輕微過敏反應(yīng)時(shí)此刻在注射抗過敏藥已不可避免子宮的腫脹,而且還會影響到采另一側(cè)子宮角的采卵管固定等工作。如發(fā)現(xiàn)較晚則會影響到采胚工作甚至牛只的生命。如發(fā)現(xiàn)牛只搖頭,并流涎,外陰紅紫既是過敏癥狀,待發(fā)現(xiàn)皮下起疹時(shí)應(yīng)加量注射抗過敏藥物,此時(shí)如還沒采對側(cè)子宮角時(shí)應(yīng)加快速度將采卵管送到位置以免回收不到胚胎。因此采用提前注射抗過敏藥可以有效避免子宮腫脹和不回液現(xiàn)象的發(fā)生。在供體牛只采胚前20 min注射抗過敏藥地賽米松等藥品,避免上述癥狀的出現(xiàn)。

3.2 采卵管故障排除

選用質(zhì)量過關(guān)的采卵管,固定氣球時(shí)球的圍度不要超過固定位置處子宮的圍度,在倒角時(shí)盡量將采卵管撤出用大量生理鹽水沖洗管內(nèi)的粘液。將采卵管固定好之后第一次進(jìn)液采用注射器推入法,用五十毫升注射器吸取20～30 mL沖卵液快速注入子宮內(nèi)以其沖出采卵管內(nèi)的粘液以便液體充分回流。

3.3 液體回流

氣囊固定位置要準(zhǔn)確,充氣要適宜。若位置太靠后,則氣囊封閉不住子宮角,沖卵時(shí)會發(fā)生丟水現(xiàn)象而回流不暢。如太靠前沖卵液不能完全沖回胚胎。采卵管氣球圍度依據(jù)子宮角粗細(xì)而定。氣球過于膨脹易損傷子宮內(nèi)膜,使其產(chǎn)生裂痕,沖卵液可滲透到粘膜固有層內(nèi)。氣球小則不能固定采卵管。如發(fā)現(xiàn)回液量小于進(jìn)液量時(shí)應(yīng)在進(jìn)液時(shí)封閉子宮角尖端或是提高其位置,使得液體不外流。

3.4 子宮角褶皺內(nèi)胚胎的回收

第一次向子宮角緩緩注入沖卵液30 mL,使子宮角充盈,粘膜皺褶展開,觸感有緊張度,同時(shí)用左手拇指捏住子宮角、輸卵管結(jié)合部并向上提,防止胚胎經(jīng)輸卵管漏斗掉到腹腔。其余手指將子宮角捏在掌心,并不斷由尖端向基部輕輕按摩,使胚胎進(jìn)入沖胚液中[6]。

[1] 郭志勤.家畜胚胎工程[M].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社, 1998.

[2] 桑潤滋.動物繁殖生物技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002.

[3] 柳堯波,黃金明.青年荷斯坦牛的超數(shù)排卵試驗(yàn)[J].中國草食動物,2004,25(1):14-16.

[4] 魏紅芳,郭建來 .牛超數(shù)排卵的方法及影響其效果的因素[J].河南畜牧獸醫(yī),2004,27(10):20-21.

[5] 章志國,張孝榮.動物超數(shù)排卵的影響因素及發(fā)展現(xiàn)狀[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,43(1):41-43.

[6] 李梁材.牛胚胎采集技巧[J].甘肅畜牧獸醫(yī),1990,21(3):38-39.