魯 哲,鄒振華,路 婧,王若仲

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410128)

植物激素是植物體內(nèi)合成的對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有顯著作用的微量物質(zhì)。目前,植物激素有六大類,即生長(zhǎng)素類 (Auxins)、赤霉素類 (GAs)、細(xì)胞分裂素類(CTKs)、脫落酸 (abscisicacid,ABA)、乙烯 (ethyne,ET H)和油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)[1]。植物激素作為植物體內(nèi)的微量信號(hào)分子,調(diào)節(jié)植物幾乎所有的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。長(zhǎng)期以來(lái),植物激素與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑一直是生物學(xué)和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其成果為農(nóng)業(yè)科技進(jìn)步做出了巨大的貢獻(xiàn)。例如,各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的廣泛使用,已成為實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要措施之一,在推動(dòng)“綠色革命”、大幅度提高作物產(chǎn)量和保證國(guó)家糧食安全方面發(fā)揮了不可替代的作用[2]。由于植物激素在植物體內(nèi)含量極低(一般每克植物組織鮮樣中的含量為 1～100 ng),易被光解、熱解和氧化,因此,如何對(duì)微量植物激素進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的定量分析,一直是植物激素研究領(lǐng)域的難題之一。近年來(lái),隨著功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)(metabolomics)等整體性“組學(xué)”方法的提出以及生物學(xué)研究對(duì)活細(xì)胞單分子行為測(cè)定的日益關(guān)注,對(duì)植物激素等重要代謝調(diào)節(jié)物的測(cè)定技術(shù)提出了更高的要求。同時(shí)植物激素的生理功能具有時(shí)空特異性,植物激素作用機(jī)理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等前沿領(lǐng)域更是迫切需要對(duì)微量植物樣品的超微量植物激素進(jìn)行高靈敏、原位、實(shí)時(shí)測(cè)定。研究植物激素在植物組織或細(xì)胞中的分布特點(diǎn)及消長(zhǎng)規(guī)律,目前常采用化學(xué)手段對(duì)內(nèi)源激素水平進(jìn)行檢測(cè),但測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性較差[3],而且無(wú)法對(duì)激素進(jìn)行定位研究,因?yàn)樵S多激素引起的很多生理反應(yīng)常發(fā)生在激素受體分布的細(xì)胞器內(nèi)[2],因此對(duì)植物激素的高靈敏、高通量、原位實(shí)時(shí)測(cè)定新技術(shù)提出了迫切要求。

傳統(tǒng)植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑測(cè)定方法主要有以早期簡(jiǎn)單的小麥胚芽鞘切段伸長(zhǎng)法為代表的生物測(cè)定法[4]、以氣相色譜法[5](Gas Chromatography,GC)和高效液相色譜法[6](High Performance Liquid Chromatography,HPLC)為代表的理化測(cè)定法,及以酶聯(lián)免疫吸附法[7](Enzyme Linked Immune sorbent Assays,ELISA)為代表的免疫測(cè)定法。傳統(tǒng)植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑測(cè)定方法各有優(yōu)缺點(diǎn),下面分別進(jìn)行評(píng)述。

1 生物鑒定法

生物鑒定法是最早使用的激素測(cè)定方法,它是利用激素作用于植株組織或器官后產(chǎn)生生理生化上的變化,通過(guò)該變化的大小推算植物激素含量的一種方法。1928年,荷蘭研究生 Fritz Went在研究燕麥胚芽鞘彎曲程度與瓊脂中生長(zhǎng)素濃度的關(guān)系時(shí),發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān),這種測(cè)定法后來(lái)被稱為燕麥測(cè)試法[8]。生物鑒定法雖然簡(jiǎn)單,對(duì)檢測(cè)儀器要求不高,但是對(duì)樣品純度要求高,專一性和重復(fù)性較差,近年來(lái)已很少使用。但對(duì)于從大量人工合成的化合物中篩選植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,生物鑒定法仍然是一種有效的植物激素定性分析方法[9]。

2 光譜及色譜檢測(cè)法

傳統(tǒng)光譜法如比色法測(cè)定植物激素,由于專一性差,已較少使用[10]。利用熒光技術(shù)與其它方法結(jié)合進(jìn)行光譜測(cè)定的新方法成為光譜法檢測(cè)植物激素的主流方法。薛泉宏等[10]對(duì)以往的赤霉素?zé)晒鉁y(cè)定的方法進(jìn)行了改進(jìn),該法適合于發(fā)酵液及固態(tài)產(chǎn)品中赤霉素的測(cè)定。光譜測(cè)定植物激素法近年鮮有報(bào)道。

色譜法是利用不同物質(zhì)在不同相態(tài)的選擇性分配,以流動(dòng)相對(duì)固定相中的混合物進(jìn)行洗脫,混合物中不同的物質(zhì)會(huì)以不同的速度沿固定相移動(dòng),最終達(dá)到分離的效果。早期采用的色譜測(cè)定方法主要是紙層析(Paper Chromatography,PPC)和薄層層析 (Thin Layer Chromatography,TLC),先將植物樣品通過(guò)層析進(jìn)行分配再通過(guò)顯色等方法進(jìn)行鑒定。這兩種方法操作簡(jiǎn)便,所需設(shè)備簡(jiǎn)單,但是分離效率和靈敏度有限,因而現(xiàn)在已很少單獨(dú)使用。將薄層層析與高效液相色譜(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合可以有效地提高檢測(cè)的靈敏度。如李兆亮[11]等先用薄層層析純化樣品,然后利用 HPLC定量分析植物葉片中的水楊酸的含量,獲得了較理想的結(jié)果。

氣相色譜和高效液相色譜是 20世紀(jì) 60年代開(kāi)始應(yīng)用于激素測(cè)定的技術(shù),現(xiàn)在已經(jīng)成為植物激素檢測(cè)的主要方法。氣相色譜法是指以氣體為流動(dòng)相的色譜法。氣相色譜分析速度快,可用于分析測(cè)定所有的植物激素,但前提是待測(cè)激素必須形成易揮發(fā)的衍生物。大部分植物激素都含有極性基團(tuán),沸點(diǎn)較高,因此在進(jìn)行GC分析前必須制備成為合適的揮發(fā)性衍生物[12]。已有一些衍生化方法被應(yīng)用于植物激素分析。如張有林等[13]用溴甲基五氟苯對(duì) ABA和IAA進(jìn)行衍生、酯化,在氣相色譜柱上分離效果良好,對(duì)電子檢測(cè)器反應(yīng)敏感,ABA和 IAA的最小檢測(cè)限各為 10-12g/mL和10-13g/mL。乙烯是以氣態(tài)存在的植物激素,因而可以不經(jīng)過(guò)衍生化直接用GC測(cè)定[14]。此外,杜黎明等建立了一種530μ m大口徑毛細(xì)管氣相色譜測(cè)定法,可以不經(jīng)衍生化處理,直接進(jìn)樣[15]。 HPLC可用于除乙烯外的所有植物激素的分析檢測(cè),其結(jié)果準(zhǔn)確性和靈敏度較高,且與 GC相比前處理簡(jiǎn)單,對(duì)所測(cè)激素結(jié)構(gòu)無(wú)破壞,因此已經(jīng)成為植物激素測(cè)定的一種常用方法。HPLC可以選用不同的檢測(cè)器,如熒光檢測(cè)器[16]、紫外檢測(cè)器[17]等。其中紫外檢測(cè)器是一種較為常用的檢測(cè)方法。

由于 HPLC和 GC在測(cè)定過(guò)程中對(duì)保留時(shí)間的分辨有一定限制,若前處理過(guò)程達(dá)不到所需純度要求可能會(huì)出現(xiàn)幾種化合物的保留時(shí)間相同或接近而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。將質(zhì)譜(Mass Spectrography,MS)技術(shù)與 HPLC或 GC聯(lián)合使用[18～21],可以有效地提高檢測(cè)的選擇性和靈敏度,因此儀器聯(lián)用是目前植物激素測(cè)定技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

3 傳統(tǒng)免疫檢測(cè)法

放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)是植物激素免疫測(cè)定傳統(tǒng)方法。放射免疫方法具有較高的靈敏度,但需要特殊的操作技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,不適于作為常規(guī)檢測(cè)方法。相對(duì)而言,酶聯(lián)免疫吸附分析方法[22]應(yīng)用更為廣泛。但ELISA在靈敏度上還不能完全滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需要。因此開(kāi)發(fā)間接的 ELISA法檢測(cè) GA3,利用 GA3～ GA7免疫家兔得到的抗血清,建立了檢測(cè)結(jié)合態(tài) GA3的間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。免疫抗原與包被抗原用最常見(jiàn)的 DCC活化羧基與蛋白質(zhì)相聯(lián),檢測(cè)極限為 12.3 ng/m L,線性范圍 12.3～ 1 000 ng/mL?？寡迮c GA3的交叉反應(yīng)率為 2.3%,與 GA,IAA,ABA和 zR的交叉反應(yīng)率均很小[23]。隨著 ELISA技術(shù)的發(fā)展,利用該技術(shù)測(cè)定各類農(nóng)作物中植物激素在代謝中作用的實(shí)例日漸增多[24～27],并且獲得了穩(wěn)定的結(jié)果。近期,有報(bào)道運(yùn)用免疫層析技術(shù)和液相電噴霧質(zhì)譜法結(jié)合的 ABA檢測(cè)方法,利用樣品在免疫層析凝膠的高專一性和靈敏度使其成為一種新型方便、高效和靈敏的分離純化方法[28]。

氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用 (GC/MS)或液-質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)等方法各有優(yōu)點(diǎn),但都存在操作繁冗、靈敏度不佳、結(jié)果重復(fù)性差、儀器昂貴或者易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等缺陷。因此,開(kāi)發(fā)高靈敏、簡(jiǎn)單、快速的用于植物激素檢測(cè)的方法非常緊迫。

4 生物傳感器檢測(cè)法

生物傳感器(biosensor)技術(shù)是將生物所具有的特性和電子裝置相結(jié)合的一種技術(shù),利用生物間特異的親和作用將信號(hào)轉(zhuǎn)換成能夠被識(shí)別的裝置。生物傳感器具有快速、實(shí)時(shí)、高度特異性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn),能夠制備成用于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的裝置[29]。按分子識(shí)別元件將生物傳感器分為酶?jìng)鞲衅?、免?抗原或抗體)傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、細(xì)胞器傳感器、核酸傳感器、分子印跡傳感器等[30]。

生物傳感器還存在一定的局限性,如使用壽命、長(zhǎng)期的穩(wěn)定性、批量生產(chǎn)工藝等都是生物傳感器研究、應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化亟待解決的。但是針對(duì)植物激素這樣一種極其不穩(wěn)定的物質(zhì),相比以往各種傳統(tǒng)方法,應(yīng)用生物傳感器測(cè)定植物激素含量,不但精確、高靈敏,而且具有操作簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)、輕巧等優(yōu)點(diǎn),因而是一種具有發(fā)展前景的植物激素測(cè)定方法。

近年來(lái),利用生物傳感器技術(shù)針對(duì)植物激素的檢測(cè)有了很大進(jìn)步。利用電化學(xué)生物傳感器方法檢測(cè)植物激素的方法逐年增多[31,32]。近年來(lái),湖南省植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,在壓電免疫傳感器、電化學(xué)傳感器及光學(xué)生物傳感器檢測(cè)植物激素方面有一定突破,是植物激素測(cè)定領(lǐng)域的又一拓展[33～36]。電化學(xué)傳感器和光學(xué)生物傳感器是微型化生物傳感器測(cè)定植物激素技術(shù)的必然發(fā)展趨勢(shì)。

5 非損傷微測(cè)定技術(shù)

非損傷微測(cè)技術(shù) (NoninvasiveMicrotest Technique,NMT)起源于美國(guó) Marine Biology Laboratory(MBL)實(shí)驗(yàn)室。 1990年 MBL的科學(xué)家Kǜ htreiber使用非損傷微電極測(cè)量了進(jìn)出細(xì)胞的Ca2+流速和運(yùn)動(dòng)方向,開(kāi)創(chuàng)了生物活體靜態(tài)測(cè)量到動(dòng)態(tài)測(cè)量轉(zhuǎn)變的先河[37]。 1995年 MBL的科學(xué)家在《Nature》發(fā)表文章闡明了非損傷微測(cè)技術(shù)的數(shù)學(xué)、物理學(xué)基礎(chǔ)以及應(yīng)用方式,進(jìn)一步完善了非損傷微測(cè)技術(shù),從此非損傷微測(cè)技術(shù)進(jìn)入各研究領(lǐng)域并發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[38]。 2010年8月,普渡大學(xué)的科學(xué)家發(fā)展了一種用碳納米管技術(shù)研制的生長(zhǎng)素(IAA)微電極,結(jié)合非損傷微測(cè)技術(shù)測(cè)定了玉米株系 B73和突變體 Br2中IAA的分布和運(yùn)輸[39]。研究表明,非損傷微測(cè)技術(shù)與信號(hào)解耦聯(lián)、整合流速相結(jié)合,利用菲克第一定律,可測(cè)定玉米根中內(nèi)源性IAA的流速。該研究使用非損傷微測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)地測(cè)定了根表面的 IAA流速,可為研究生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸,感受重力,研究活體植物根的發(fā)育和幼苗的調(diào)控機(jī)制提供重要幫助。

6 展 望

植物激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及代謝有重要作用,對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高靈敏、高通量、原位實(shí)時(shí)定量測(cè)定成為一項(xiàng)必然的工作。傳統(tǒng)植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑測(cè)定方法各有優(yōu)缺點(diǎn),以高效液相色譜法為代表的理化檢測(cè)法依然是現(xiàn)今植物激素檢測(cè)的主流,但是多與儀器聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)成本較高。隨著生物傳感器法對(duì)植物激素測(cè)定的日益完善,可以達(dá)到實(shí)時(shí)快速測(cè)定、檢測(cè)成本不高,進(jìn)一步解決原位檢測(cè)的困難,其將有很大的發(fā)展空間。非損傷微測(cè)技術(shù)在生物微傳感器方面的應(yīng)用,值得密切關(guān)注。非損傷微測(cè)技術(shù),其優(yōu)勢(shì)在于對(duì)植物無(wú)損傷,原位實(shí)時(shí)進(jìn)行植物激素的檢測(cè),有較為廣闊的應(yīng)用前景,但目前因?yàn)榧夹g(shù)原因,對(duì)測(cè)定痕量植物激素方法有待進(jìn)一步提高。將非損傷微測(cè)技術(shù)與生物傳感器聯(lián)合應(yīng)用于對(duì)植物激素檢測(cè)將是未來(lái)植物激素檢測(cè)的必然趨勢(shì)。

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