鐵富萍，李 春，劉永林

（青海省海晏縣畜牧獸醫(yī)站，海晏 812200）

綿羊弓形蟲病的ELISA診斷

鐵富萍，李 春，劉永林

（青海省海晏縣畜牧獸醫(yī)站，海晏 812200）

弓形體?。╰oxoplasmosis）又名弓形蟲病或弓漿蟲病，是由剛地弓形蟲（toxoplasme gondii）引起的人畜共患的寄生蟲病，其病原體是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的致病原蟲，在自然界廣泛分布，寄主范圍廣，可感染人和豬、馬、牛、羊、狗、貓等多種動(dòng)物，其臨床表現(xiàn)多樣，從無癥狀隱形到亞臨床到顯性、重癥以致死亡，主要侵害幼畜和新生仔畜，羔羊發(fā)病后常表現(xiàn)為免疫力低下、生長緩慢、消瘦、貧血以及呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引起死亡，懷孕母羊感染后常引起廣泛病變而導(dǎo)致流產(chǎn)、不孕、死胎［1］，造成繁殖障礙。為了摸清青海省海晏縣羊群中弓形體病的感染情況，我們于2009年8月，應(yīng)用ELISA方法進(jìn)行了弓形蟲的抗體檢測，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 抗原 P30由日本國家原生動(dòng)物疾病研究控制中心提供，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)所生物技術(shù)研究室保存。P30簡介如下：編碼T.gondii的表面抗原l（SAGl，P30）被克隆到PGEX-4T-3質(zhì)粒上，再表達(dá)在E.coli上。

1.2 被檢血清的采集和處理 94份被檢血清均采自青海省海晏縣哈勒景鄉(xiāng)永豐村的流產(chǎn)較嚴(yán)重的綿羊群中的生產(chǎn)母羊，采血時(shí)均空腹、頸靜脈采集，采集后擺成斜面，置4℃冰箱5 h后，放在室溫待血清析出后收集血清，-20℃冷凍保存待檢。

1.3 其他試劑和耗材 均購自國內(nèi)和Sigma公司供應(yīng)商。

1.4 ELISA

1.4.1 抗原的包被 抗原GST-SAG1t和GST，按5 μg/mL劑量加到包被液中（50 mmol/L carbonate bicarbonate buffer，pH 9.6），混勻后加到 96 孔平底微量板（castor）的孔里，每孔50 μL，在4℃條件下培養(yǎng)過夜。

1.4.2 封阻 用含有0.05%Tween 20的PBS沖洗液沖洗1次后，殘留粘附物的部位用含3%脫脂乳的封阻液（3 g脫脂乳粉+90 mL蒸餾水+10 mL 10×PBS液）進(jìn)行封阻，每孔100 μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.3 加樣 隨后微量板用沖洗液沖洗6次，在封阻液中按1∶100滴度稀釋被檢血清后，每個(gè)樣品平行加到微量板的兩個(gè)孔中，每孔50 μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.4 加二抗 用沖洗液沖洗6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀釋辣根過氧化物酶結(jié)合了綿羊的IgG抗體，稀釋后每孔加50 μL，并在37℃條件下培養(yǎng)1 h。

1.4.5 底物 用沖洗液沖洗6次后，每孔加100 μL底物（每毫升底物中含有0.3 μg ABTS，0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液pH 4.0和0.003%H2O2），在室溫陰暗處放置1 h后讀數(shù)。

1.4.6 讀數(shù) 用Wellscan MK 3酶標(biāo)讀數(shù)儀（Labsystems Dragon，F(xiàn)inland）在光吸收值OD 415nm條件下測定光吸收值（OD）。

1.4.7 判定標(biāo)準(zhǔn) ELISA滴度表示成最大稀釋度的倒數(shù)，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GSTSAG1t孔和GST孔之間的光密度吸收值是不同的，兩個(gè)孔之間的差值為該被檢樣品的光密度吸收值（OD值）。兩孔陽性血清對照孔的平均值必須大于0.1；兩孔陰性血清對照孔的平均值必須低于0.1；兩孔待檢樣品的平均值等于或大于0.1為陽性，低于0.1為陰性。

2 結(jié)果

調(diào)查表明，所檢測的110份被檢血清中，共檢出T.gondii抗體陽性血清14份，陽性率12.73%。

3 討論

3.1 通過本次檢測海晏縣的110份綿羊血清，檢測出陽性14份，陽性率12.73%，這比王曉燕報(bào)道［2］的海晏縣綿羊弓形蟲病的感染率4.22%高3倍，比張曉強(qiáng)等報(bào)道［3］的天俊縣土種藏系羊弓形蟲病的感染率3.70%高4倍。說明海晏縣的綿羊群中存在弓形蟲病的感染，要引起有關(guān)部門的高度重視，應(yīng)采取相應(yīng)的防制措施。并定期對海晏縣全縣的綿羊群進(jìn)行弓形蟲病的血清學(xué)檢測，檢出陽性及時(shí)淘汰，凈化本病，從而使海晏縣的畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)保持穩(wěn)定的發(fā)展。

3.2 本研究采用了一個(gè)具有免疫原性的表面T.gondii的抗原l（SAGl，P30）。編碼T.gondii的表面抗原l（SAGl，P30）被克隆到PGEX-4T-3質(zhì)粒上，隨后谷丙酰胺轉(zhuǎn)移酶融合蛋白一樣被克隆表達(dá)在E.coli上。重組的SAGl（rSAGl）被重新折疊在8M的尿素溶液，接著透析，最后用ELISA方法在弓形蟲病的血清學(xué)診斷上進(jìn)行了評估，ELISA方法在弓形蟲病的血清學(xué)診斷上具有敏感、特異的特點(diǎn)。

3.3 弓形蟲是寄生于人和哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的機(jī)會性致病原蟲，與這些動(dòng)物的親密接觸和食用這些動(dòng)物的肉類尤其是生的或半生不熟的肉類是導(dǎo)致人類感染的主要原因之一。加強(qiáng)中間宿主貓的管理，盡量少養(yǎng)貓或不養(yǎng)貓，防止貓進(jìn)入圈舍，嚴(yán)防貓的糞便污染草場、食物和飲用水，凡是可能被污染的草場，均用較強(qiáng)的消毒劑進(jìn)行消毒來殺死草叢中的卵囊，并加強(qiáng)滅鼠工作，各種肉食品在使用前均應(yīng)充分煮熟，不吃生的或半生不熟的肉類和生乳等，切生、熟肉的用具應(yīng)分開。發(fā)現(xiàn)貓感染弓形蟲病要及時(shí)淘汰，也可用藥物進(jìn)行治療，確保人畜安全。治療藥物有乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺六甲嘧啶、敵菌凈和乙酰螺旋霉素、克林霉素等。

致謝：在采血過程中得到青海省海晏縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站同志的幫助，在檢測過程中得到青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院馬利青、蔡其剛等老師的幫助，在此一并致謝。

［1］朱錦沁，袁生馨.高原人畜共患?。跰］.西安：陜西人民出版社，1994.

［2］王曉燕.青海省海晏縣綿羊弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查［J］.青海省畜牧獸醫(yī)雜志，2007，37（4）：29.

［3］張曉強(qiáng).天俊縣土種藏系羊弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查［J］.青海省畜牧獸醫(yī)雜志，2009，39（1）：29.

2011-02-24

鐵富萍（1976-），男，獸醫(yī)師。

1007-9726（2011）03-0071-02

S858.26