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        實時熒光PCR技術(shù)在手足口病原學(xué)檢查中的應(yīng)用

        2011-08-15 00:45:01王七生秦金勇蔣立立
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2011年17期
        關(guān)鍵詞:檢測

        王七生,秦金勇,蔣立立

        桂林市疾病預(yù)防控制中心檢驗科,廣西桂林 541001

        手足口病是腸道病毒引起的急性傳染病,具有流行性強、傳染性強、傳播途徑復(fù)雜等特點,好發(fā)于兒童(5歲以下),手足口病較常見的病原體是柯薩奇病毒A16型(CoxA16)和腸道病毒71型(EV71)[1-2]。近年來該病呈現(xiàn)出了新的特點:①發(fā)病高峰期明顯提前;②全國高發(fā)地區(qū)區(qū)域擴大,且發(fā)病強度高于往年;③發(fā)病90%以上為5歲以下兒童,托幼兒童和散居兒童大約各占一半;④實驗室確診的病例大多數(shù)是EV71型,危重患兒病例增加。這為及早、迅速和準確地檢測確定手足口病原體傳染性疾病的治療與預(yù)防提出了更高的要求。本文采用實時熒光PCR技術(shù),對桂林市婦女兒童醫(yī)院確診的手足口病患兒進行腸道病原學(xué)進行鑒別與分析?,F(xiàn)將實驗報道如下:

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        樣本來源于桂林市婦女兒童醫(yī)院,2010年臨床確診為手足口病的患兒,共40例,診斷依據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病預(yù)防控制指南》(2008 版)[3]。 年齡 0.75~10.00 歲,平均 3.15 歲。均使用肛拭子法采集患兒糞便標本,共計40份樣本,樣本均按照《手足口病預(yù)防控制指南》的要求進行采集儲存及轉(zhuǎn)運操作。

        1.2 方法

        1.2.1 標本采集 樣本采集使用肛拭子法,用無菌棉簽采集患兒的糞便,放于病毒漢格氏液保存管,冷藏運至實驗室,-20℃保存,取上清200 μl用于提取病毒RNA[4]。

        1.2.2主要試劑及儀器 本實驗室用熒光PCR儀器為美國ABI公司生產(chǎn),型號為7500。所用分光光度計為美國Varian生產(chǎn)的Cary50Probe紫外光度計。所用超速離心機為德國Eppendorf生產(chǎn)。試劑盒包括提取RNA的試劑盒等均購于北京金豪生物有限公司。

        1.2.3 檢測試劑 腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒,適用于EV71、柯薩奇病毒的核酸篩查,柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒(CVA-16)適用于柯薩奇病毒A-16病毒核酸的特異性檢測;腸道病毒71型核酸檢測試劑盒(EV71)適用于腸道病毒71型核酸的特異性檢測[4-5]。引物及探針信息:EV-Com引物(上游):5’-GTG TGT CGT AAC GGG CAA CTC-3’;EV-Com 引物(下游):5’-TTT CAA TTG TCA CCA TAA GCA GC-3’;EV-Com 熒 光 探 針 :5’-ACC GAC TAC TTT GGG TGT CCG TGT TTC C-3’;CVA-16 引物(上游):5’-CCA TTG GTG CTC CCA CTA CA-3’;CVA-16 引物(下游):5’-GCT TCA GTG TTG GCA GCT GTA G-3’;CVA-16 熒光探針:5’-CTG TGA ACA ACC AAG TAA ACC GCT CC-3’;EV71 引物(上游):5’-CAG AAC ACA CAG GTG AGC AGT C-3’;EV71 引物(下 游):5’-GCG TGT CTC AAT CAT ACT CTC ATC-3’;EV71 熒光探針:5’-CCA GCA CTC CAA GCT GCT GAA ATT GG-3’。

        1.2.4 實時熒光PCR檢測 肛拭子法提取并處理的40份樣本,按照試劑盒說明書操作,首先使用Trizol法提取標本的RNA,然后在擴增儀上將萃取得到的RNA進行擴增,最后根據(jù)PCR試劑盒提供的優(yōu)化方法進行退火溫度、離子濃度、探針濃度、引物濃度等優(yōu)化處理,并建立標準曲線[6-7]。標準曲線建立方法即:將陽性標準品置于260 nm紫外光下進行吸光度測定,以計算出DNA的拷貝數(shù)。并分別連續(xù)10倍稀釋且進行熒光PCR檢測以獲得標準曲線,且經(jīng)重復(fù)性、敏感性檢測。所有操作完成時間為3~4 h。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

        將實驗數(shù)據(jù)建立Excel數(shù)據(jù)庫,采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析,計量資料采用非參數(shù)秩和檢驗。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 樣本標準曲線

        用10倍倍比稀釋的標準模板作定量標準曲線,CVA-16標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.914,曲線斜率為-3.167;EV71標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.952,曲線斜率為-3.382;EVCom標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.964,曲線斜率為-3.386。線性相關(guān)性良好。PCR擴增效率為94%,說明PCR反應(yīng)對模板的擴增很完全。

        2.1 肛拭子標本的實時熒光PCR檢測結(jié)果

        40份肛拭子標本通過前述3種核酸檢測試劑盒的實時熒光PCR檢測,檢測結(jié)果:腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒(EV-Com)陽性為22例,柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒(CVA-16)陽性為9例(占22.5%),腸道病毒71型核酸檢測試劑盒(EV71)陽性為12例(占30%),其中CVA-16或EV71陽性,都同時為EV-Com陽性。EV-Com陽性病例的肛拭子標本采集時間為起病后1~7 d,發(fā)病3 d的肛拭子樣本EV-Com陽性病例占75%。

        3 結(jié)論

        實時熒光PCR是一種核酸定量技術(shù),具有普通PCR的高靈敏性[8],已經(jīng)成為腸道病毒診斷的重要手段。本研究中采用實時熒光PCR方法,嚴格按照檢測試劑盒說明書操作,對利用肛拭子法采集的共40份標本進行了病毒Cox A16和EV71的核酸檢測。結(jié)果CVA-16標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.914;EV71標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.952,柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒(CVA-16)陽性為9例,腸道病毒71型核酸檢測試劑盒(EV71)陽性為12例,結(jié)果與有關(guān)文獻相似[9]。研究發(fā)現(xiàn)手足口病病毒檢出率與標本的采集時間相關(guān)性,發(fā)病前3 d的肛拭子樣本進行檢查更利于病原學(xué)檢出。而CVA-16和EV71腸道病毒還是手足口病的主要病原體,實時熒光PCR技術(shù)對手足口病的病原診斷具有重要價值,它操作簡便,穩(wěn)定性良好,重現(xiàn)性好[10],可以在3~4 h內(nèi)獲得檢測結(jié)果,可以作為手足口病腸道病毒的快速檢測方法,為臨床及時采取救治方案提供一種早期診斷依據(jù)[11]。

        [1]張暢斌,尹愛華,何天文,等.一種經(jīng)濟便捷的手足口病原RNA提取方法[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(21):81-82.

        [2]金玉娟,甘莉萍,陳應(yīng)堅,等.腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型實驗室檢測研究進展[J].職業(yè)與健康,2009,25(17):1878-1880.

        [3]中華人民共和國衛(wèi)生部.2008年手足口病預(yù)防控制指南[J].中華實驗和臨床感染病雜志:電子版,2008,2(3):210-213.

        [4]劉穎悅,張國成,許東亮,等.西安地區(qū)手足口病患兒咽拭子中EV71的檢測及分離鑒定[J].臨床兒科雜志,2010,28(11):136-139.

        [5]Tan EL,Yong LL,Quak SH,et al.Rapid detection of enterovirus71 by real-time Taq Man RT-PCR[J].J Clin Virol,2008,42:203-206.

        [6]Chen TC,Chen GW,Hsiung CA,et al.Combining multiplex reverse transcription-PCR and a diagnostic microarray to detect and differentiate enterovirus 71 and coxsackievirus Al6[J].J Clin Micro,2006,44:2212-2219.

        [7]楊曉紅,莊宇,代宏劍,等.實時熒光定量PCR檢測兒童手足口病腸道病毒 EV71[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2010,31(11):1337-1338.

        [8]陳賢革.熒光PCR技術(shù)應(yīng)用的研究進展[J].畜牧與飼料科學(xué),2010,31(2):162-164.

        [9]雷永良,陳秀英,葉碧峰,等.實時熒光定量PCR在手足口病腸道病毒快速檢測中的應(yīng)用[J].中國病原生物學(xué)雜志,2008,8(10):738-739.

        [10]陳祿彪,張廣錚,施巧素,等.手足口病病原的熒光PCR法檢測及其臨床特點──附20例分析[J].新醫(yī)學(xué),2009,40(7):464-466.

        [11]何雅青,何麗蕓,姚相杰,等.熒光定量RT-PCR快速檢測手足口病病原研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2008,8(10):1675-1677.

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