馬思泉

山東省菏澤市第二人民醫(yī)院胸外科，山東菏澤 274005

乳腺癌近年來(lái)發(fā)病率呈直線上升趨勢(shì)，而且發(fā)病年齡趨于年輕化，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者的主要死亡原因。目前患者體內(nèi)存在的微小轉(zhuǎn)移癌灶尚難發(fā)現(xiàn)，早期篩選出具有轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)性的患者，予以徹底控制是提高乳腺癌療效的關(guān)鍵。本研究旨在探討組織蛋白酶D（cathepsin D，Ca-D）和E-鈣黏附蛋白（epithelial Cadherin， E-Ca）在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，并預(yù)測(cè)其在預(yù)后估計(jì)中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫(yī)院2002～2008年手術(shù)切除后經(jīng)病理證實(shí)，且有3年以上隨訪資料的女性乳腺癌患者106例作為研究對(duì)象，同時(shí)選取乳腺增生性病變即纖維腺瘤作為對(duì)照。患者年齡21～81歲，采取乳腺癌根治或改良根治術(shù)?；颊咝g(shù)前未經(jīng)過(guò)任何治療，術(shù)后進(jìn)行正規(guī)化療。

1.2 分組

按照同側(cè)腋窩淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)分為3組：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為第1組，轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)1～3個(gè)（含3個(gè)）者為第2組，轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)4個(gè)或4個(gè)以上者為第3組。

1.3 染色方法及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶法（S-P法）染色法（S-P試劑盒及一抗均購(gòu)自福州邁新公司），DAB顯色，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

采用雙盲法。陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色顆粒狀，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)算著色腫瘤細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。按照參考文獻(xiàn)對(duì)不同抗體染色結(jié)果進(jìn)行判斷，CD34染色標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，先在低倍鏡下找到新生血管密集區(qū)，在200倍視野下觀察、計(jì)數(shù)5個(gè)視野下血管總數(shù)，取其平均值作為該患者的微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS1.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

以觀察滿3年時(shí)患者生存狀態(tài)為判斷依據(jù)，其中無(wú)瘤存活者55例（文中以后稱無(wú)復(fù)發(fā)組），出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者51例（文中以后稱復(fù)發(fā)組）。腫瘤發(fā)生部位左側(cè)（61例）多于右側(cè)（45例）?；旌闲园?2例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌77例，浸潤(rùn)性小葉癌17例（分析數(shù)據(jù)時(shí)將混合型和小葉癌合并），浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌明顯多于小葉癌，兩者比例約4.5∶1。

2.2 E-Ca在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

2.2.1 E-Ca蛋白在乳腺組織中的表達(dá) E-Ca在正常乳腺癌組織內(nèi)呈強(qiáng)表達(dá)，在癌組織內(nèi)表達(dá)減弱。E-Ca的陽(yáng)性率在浸潤(rùn)性小葉癌中為51.7%（15/29），導(dǎo)管癌中為76.4%（55/72），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 E-Ca蛋白表達(dá)相關(guān)因素 E-Ca蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈相關(guān)趨勢(shì)，低表達(dá)者容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶E-Ca蛋白表達(dá)降低。E-Ca蛋白表達(dá)與復(fù)發(fā)、部位、腫瘤大小、生存期均無(wú)關(guān)。

2.3 Ca-D在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

2.3.1 Ca-D在乳腺癌組織內(nèi)的表達(dá) Ca-D在正常乳腺癌組織內(nèi)無(wú)表達(dá)或微弱表達(dá)，在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng)。Ca-D在乳腺腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)都有不同程度的表達(dá)，不同腫瘤表達(dá)部位有所不同。

2.3.2 Ca-D在乳腺癌組織不同部位表達(dá)相關(guān)因素 分別觀察Ca-D在乳腺腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①間質(zhì)內(nèi)Ca-D的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)呈正相關(guān)：低表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為50%（12/24），復(fù)發(fā)率為33.3%（8/24），中表達(dá)組轉(zhuǎn)移率為60.7%（17/28），復(fù)發(fā)率為42.9%（12/28），強(qiáng)表達(dá)組轉(zhuǎn)移率為79.1%（34/43），復(fù)發(fā)率為69.8%（30/43）； 強(qiáng)表達(dá)組轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高，與生存期呈負(fù)相關(guān)。②腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)Ca-D的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存狀態(tài)及生存期無(wú)關(guān)。

Ca-D表達(dá)與腫瘤大小、病理類(lèi)型、年齡無(wú)關(guān)。

2.4 乳腺癌組織中MVD的臨床意義

2.4.1 MVD與生存狀態(tài)的關(guān)系 存活組MVD最小值43，最大值158，平均值79.8947，標(biāo)準(zhǔn)差為25.4418；復(fù)發(fā)組MVD最小值36，最大值2.6，平均值103.1136，標(biāo)準(zhǔn)差為33.3635，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.246，P=0.001）。

2.4.2 MVD與生存期的關(guān)系 MVD與生存期存在負(fù)相關(guān)（r=-0.301，P=0.006），MVD 越高，生存期越短。

MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、病理類(lèi)型均無(wú)相關(guān)性。

2.5 nm23-H1在乳腺組織中的表達(dá)及其生物學(xué)意義

2.5.1 nm23-H1蛋白在乳腺組織內(nèi)的表達(dá) nm23-H1蛋白在良性乳腺病變內(nèi)呈強(qiáng)表達(dá)，在乳腺癌組織中表達(dá)下降，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織可見(jiàn)強(qiáng)表達(dá)，尤其是在轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)病灶甚至無(wú)表達(dá)。

2.5.2 nm23-H1蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 nm23-H1低表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為83.3%（25/30），高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為54.5%（24/44），nm23-H1蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。

2.5.3 nm23-H1蛋白表達(dá)與生存狀態(tài)的關(guān)系 nm23-H1低表達(dá)組復(fù)發(fā)率為76.7%（23/30），高表達(dá)組復(fù)發(fā)率為40.9%（18/44）， 低表達(dá)組復(fù)發(fā)率高于高表達(dá)組。nm23-H1蛋白表達(dá)水平與復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)。

2.5.4 nm23-H1蛋白表達(dá)與生存期的關(guān)系 nm23-H1高表達(dá)

者存活時(shí)間長(zhǎng)，低表達(dá)者存活時(shí)間短，nm23-H1蛋白表達(dá)與生存期呈正相關(guān)。

2.5.5 nm23-H1和腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)Ca-D的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)nm23-H1和腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)Ca-D的表達(dá)存在相關(guān)性，兩者同時(shí)低表達(dá)者占12.5%（9/72），同時(shí)高表達(dá)者占47.2%（34/72），兩者呈正相關(guān)（r=0.264，P=0.025），目前尚未見(jiàn)該方面報(bào)道。

3 討論

3.1 E-鈣黏附蛋白和微血管密度與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

E-鈣黏附蛋白是一類(lèi)介導(dǎo)細(xì)胞間粘連作用的跨膜糖蛋白，對(duì)維護(hù)上皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用。E-Ca表達(dá)下降或缺失，細(xì)胞間的相互粘附力下降，造成細(xì)胞容易分散而向外浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，一旦獲得轉(zhuǎn)移的條件，就可以脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。乳腺癌患者的E-Ca的喪失與腫瘤的浸潤(rùn)性、低分化和預(yù)后差有關(guān)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，將E-Ca的cDNA轉(zhuǎn)染具有浸潤(rùn)性的惡性腫瘤細(xì)胞株，則可抑制后者的移動(dòng)。

本組資料未發(fā)現(xiàn)E-Ca與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)期預(yù)后的相關(guān)性，筆者認(rèn)為E-Ca作為預(yù)測(cè)指標(biāo)不理想。但其在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和小葉癌中的表達(dá)陽(yáng)性率不同，可以在腫瘤分化比較差的情況下輔助鑒別診斷。

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)依賴血管的過(guò)程。乳腺癌是典型的血管依賴性腫瘤。當(dāng)腫瘤體積超過(guò)1 ～ 2 mm3時(shí)，維持其繼續(xù)生長(zhǎng)有賴于新生血管的生成。研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤微血管密度的增加，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能也明顯增加。Narita等[4]對(duì)100例乳腺癌患者進(jìn)行多因素研究，分析其年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)受累狀況、雌激素受體、微血管、P53等9個(gè)因素與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果提示MVD在淋巴結(jié)陰性組中可獨(dú)立作為預(yù)后指標(biāo)，但在淋巴結(jié)陽(yáng)性組MVD與術(shù)后生存期無(wú)關(guān)。在無(wú)復(fù)發(fā)組中，MVD高低與淋巴結(jié)陽(yáng)性和陰性患者術(shù)后長(zhǎng)期生存都有良好的相關(guān)性。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MVD與生存狀態(tài)及生存期有關(guān)，MVD高患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移，生存期縮短。腫瘤組織內(nèi)MVD可作為一種新的反映腫瘤微血管形成強(qiáng)度與侵襲性必然聯(lián)系的生物學(xué)指標(biāo)，作為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)報(bào)因子，判斷預(yù)后。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)MVD的高低與E-Ca的表達(dá)有相關(guān)性，E-Ca蛋白表達(dá)降低，MVD增高，可能是由于細(xì)胞之間黏附性降低，新生血管容易長(zhǎng)入的緣故。

3.2 組織蛋白酶D和nm23-H1

Ca-D是一種含天冬氨酸的蛋白酶，正常情況下存在于細(xì)胞溶酶體內(nèi)，由雌激素誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有直接消化細(xì)胞外間質(zhì)或間接破壞基底膜的作用，也可發(fā)揮生長(zhǎng)因子的作用。在蛋白質(zhì)分解代謝和組織修復(fù)過(guò)程中可有少量分泌。臨床研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)失控時(shí)Ca-D分泌增加。這種異常分泌的蛋白酶是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)衰老退化從而導(dǎo)致癌細(xì)胞浸潤(rùn)和擴(kuò)散的主要原因。

很多臨床研究者認(rèn)為Ca-D可以獨(dú)立作為預(yù)后值[5-6]，在淋巴結(jié)陰性的患者組中腫瘤間質(zhì)內(nèi)Ca-D呈中等至強(qiáng)陽(yáng)性時(shí)，瘤細(xì)胞核分裂數(shù)目較高，組織學(xué)分級(jí)低，無(wú)病期及總生存期短[7]。腫瘤浸潤(rùn)性越強(qiáng)，間質(zhì)反應(yīng)越明顯，瘤細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子刺激間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Ca-D，降解結(jié)締組織，有利于腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，但相反的意見(jiàn)認(rèn)為，在腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或弱表達(dá)、在間質(zhì)中高表達(dá)可能提示預(yù)后較好[8]。

本組數(shù)據(jù)顯示組織蛋白酶D表達(dá)存在異質(zhì)性，只有間質(zhì)細(xì)胞Ca-D表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、生存期有關(guān)，高表達(dá)者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高、容易復(fù)發(fā)、生存期縮短。

nm23-H1是一種與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，多數(shù)研究結(jié)果表明乳腺癌組織中nm23-H1基因蛋白表達(dá)水平降低將增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果表明，59.5%的乳腺癌組織中nm23-H1基因表達(dá)較高，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道相近。nm23-H1基因低表達(dá)組患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為83.33%，復(fù)發(fā)率為76.67%，明顯高于nm23-H1蛋白高表達(dá)組（分別為54.55%和40.91%），nm23-H1蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，與生存期呈正相關(guān)[9-10]，而與患者的發(fā)病年齡、組織學(xué)分類(lèi)、腫瘤大小無(wú)關(guān)。因此檢測(cè)nm23-H1基因表達(dá)可作為臨床預(yù)測(cè)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢(shì)的重要參考指標(biāo)之一[11]。

筆者還發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞Ca-D與nm23-H1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，支持腫瘤間質(zhì)內(nèi)Ca-D表達(dá)增高作為預(yù)后不良的判斷指標(biāo)。

腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多步驟、多因素的復(fù)雜過(guò)程，通過(guò)本研究筆者認(rèn)為在乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，E-鈣黏附蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞之間的黏附性、間質(zhì)內(nèi)微血管密度增高。這些新生血管把腫瘤細(xì)胞和循環(huán)系統(tǒng)直接連接起來(lái)，使腫瘤細(xì)胞賴以生長(zhǎng)的物質(zhì)交換得以進(jìn)行。此外新生血管還可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的通道，通過(guò)新生血管將原發(fā)癌細(xì)胞輸送到轉(zhuǎn)移靶器官。腫瘤細(xì)胞nm23-H1表達(dá)減弱，組織蛋白酶D分泌減弱，可能誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞Ca-D合成增多，降解結(jié)締組織，有利于腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。利用乳腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行免疫組化標(biāo)記nm23-H1、MVD和Ca-D有助于預(yù)后的判斷。

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