● 唐曉敏 秦正玉 何宗寶 王家琳 吳生兵 汪克明

缺血性腦卒中是由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧而引起的局限性腦組織的壞死或腦軟化。本病屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇，源于《內(nèi)經(jīng)》對中風(fēng)病因病機(jī)的認(rèn)識。針灸在治療缺血性腦卒恢復(fù)期的治療中具有優(yōu)勢，一定程度上提高了缺血性腦卒中患者的神經(jīng)功能恢復(fù)［1，2］。電針治療對缺血再灌注大鼠模型神經(jīng)功能恢復(fù)及海馬區(qū)神經(jīng)可塑性相關(guān)基因15(CPG15，candidate plasticity－related gene 15)表達(dá)會產(chǎn)生怎樣影響，CPG15在針刺抗腦缺血損傷中樞神經(jīng)重塑過程中的作用機(jī)制是怎樣的，本實驗對此進(jìn)行了探討。

1 材料

1.1 動物 健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量為220±20g，購自南京安立默實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2009－0007號。同等條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。按照隨機(jī)分組方法，將60只SD大鼠分為正常對照組、腦缺血再灌注模型組、電針“百會、風(fēng)府”組、電針非經(jīng)穴組、尼莫地平治療組，每組各12只。

1.2 藥品 水合氯醛，批號:W20091022，生產(chǎn)企業(yè):中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;80萬單位青霉素，批號:20100627，生產(chǎn)企業(yè):哈藥集團(tuán)制藥總廠;尼莫地平，批號:20100509，生產(chǎn)企業(yè):上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司;多聚甲醛，批號:091020，生產(chǎn)企業(yè):中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司。

1.3 主要試劑及儀器 CPG15單克隆抗體(BS－2464R)，生產(chǎn)批號:909881W，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SP－9000，生產(chǎn)批號812257A，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;3－二氨基聯(lián)苯胺(diam inobenzidine，DAB)顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;一抗稀釋液，購自碧云生物技術(shù)研究所;抗原修復(fù)液，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;L734型冷光立式四孔手術(shù)無影燈，上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療器械五廠;PCE－A型程控電針治療儀，安徽天恒有限公司制;932型電熱燒灼器，上海醫(yī)療器械八廠;TB－718自動包埋機(jī)，泰維電子設(shè)備有限公司;LEICA RM2135自動切片機(jī)，LEICA公司;TK2218I恒溫攤片烤片機(jī)，泰維電子設(shè)備有限公司;OLYMPUS VANOX顯微鏡，日本OLYMPUS光學(xué)工業(yè)株式會社;LEICA ASP200自動脫水機(jī)，LEICA公司;南京捷達(dá)JD2801形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)，南京捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.4 實驗條件 動物于安靜的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫控制在(24±1)℃的范圍、相對濕度(55±5)%的環(huán)境中，12h明暗交替，塑料籠內(nèi)以無菌木屑做墊料，食水自取。

2 方法

2.1 模型制作方法 參照Zea Longa方法［3］，使用一端涂抹硅樹脂尼龍絲，將尼龍絲插入右側(cè)頸內(nèi)動脈，閉塞大腦中動脈(MCA)，阻斷MCA的血流2小時，后將尼龍絲輕輕拔出，從而復(fù)制腦缺血再灌注(BI/R)大鼠模型，模型復(fù)制成功的標(biāo)志為大鼠出現(xiàn)右側(cè)Horner綜合征(左側(cè)瞳孔縮小)，麻醉清醒時出現(xiàn)左前肢或左前后肢癱瘓，線栓拔出后頸內(nèi)動脈、Willis環(huán)無血栓及出血為標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后傷口部碘伏消毒，術(shù)后3天連續(xù)腹腔注射青霉素鈉(8萬U/d)預(yù)防感染。

2.2 神經(jīng)功能缺損評分 采用Longa 5分法標(biāo)準(zhǔn)［3］，在大鼠腦缺血2h再灌注動物蘇醒時和治療2周后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分:0分，無神經(jīng)損傷癥狀;1分，不能伸展對側(cè)前爪;2分，向外側(cè)劃圈;3分，向?qū)?cè)傾倒;4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

2.3 治療方法 電針經(jīng)穴組選擇“百會”、“風(fēng)府”穴，具體定位:“百會”穴位于大鼠頂骨與頂間骨之間凹陷處;“風(fēng)府”穴位于枕骨下方正中凹陷處。針刺方法:穴位處常規(guī)消毒后，以30號1寸毫針斜刺入“百會”穴、“風(fēng)府”穴約0.5寸，將針柄分別連接至電針儀上，“百會”穴接陰極，“風(fēng)府”穴接陽極，電針頻率2Hz，疏波，強(qiáng)度以大鼠安靜耐受為度，一般3～5mA，時間30min，每天1次，均在上午10點左右進(jìn)行，連續(xù)治療2周。電針非經(jīng)穴組統(tǒng)一選擇右臀部非經(jīng)非穴位置針刺，接電針刺激，刺激參數(shù)同電針經(jīng)穴組。西藥治療組以尼莫地平混懸液，按20mg/kg·d量灌胃，每日2次(上午8點，下午4點)，連續(xù)灌胃治療2周。

2.4 標(biāo)本取材 于造模后2周各個相應(yīng)的時間位點以10%水合氯醛麻醉(3.6mL/kg)大鼠，打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管至主動脈，向內(nèi)快速注入37℃肝素化生理鹽水250mL，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250mL，灌流固定30min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定1d，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

2.5 指標(biāo)檢測 SP染色:Ⅰ抗CPG15稀釋濃度為1∶100，陰性對照組采用正常山羊血清替代Ⅰ抗進(jìn)行，DAB2H2O2顯色液顯色，蘇木精輕度復(fù)染。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)處理 根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶的定位方法，相近部位同倍10×40，7個不同視野，采用南京捷達(dá)JD－801圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞總面積單位和平均光密度值。所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能缺損評分對比 見表1。由表1可以看出模型組大鼠神經(jīng)功能缺損顯著差于正常對照組，P＜0.01。電針經(jīng)穴組與西藥治療組大鼠神經(jīng)功能評分差異不顯著，P＞0.05;而較模型組兩者均有顯著性差異，P＜0.01;較正常對照組有一定差異性，P＜0.05。電針非經(jīng)穴組大鼠神經(jīng)功能缺損評分與模型組比較差異不明顯，P＞0.05，且顯著弱于電針經(jīng)穴組和西藥對照組，P＜0.01。

表1 各組實驗大鼠神經(jīng)功能缺損評分治療前后對比(分)

表1 各組實驗大鼠神經(jīng)功能缺損評分治療前后對比(分)

注:與正常對照組比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05;與腦缺血再灌注模型組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05;與電針“百會、風(fēng)府”組比較，##P＜0.01，#P＜0.05;與電針非經(jīng)穴組比較，★★P＜0.01，★P＜0.05;與尼莫地平治療組比較，◆◆P＜0.01，◆P ＜0.05。

周后正常對照組 12 0 0＊＊#★★◆組別 數(shù)量(只) 治療前 2模型組 12 2.796 ±0.186 2.524 ±0.482▲▲##◆◆電針經(jīng)穴組 12 2.652 ±0.224 0.794 ±0.156▲＊＊★★電針非經(jīng)穴組 12 2.787 ±0.253 1.986 ±0.269▲▲##◆◆西藥治療組 12 2.543 ±0.149 0.788 ±0.346▲＊＊★★

3.2 光鏡下觀察結(jié)果 光鏡下，正常組只見極少量棕褐色的CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)，而BI/R模型組、電針經(jīng)穴組、電針非經(jīng)穴組、藥物治療組腦中均可見不同程度的棕褐色的CPG15陽性細(xì)胞，以海馬區(qū)陽性細(xì)胞密度增加為顯著。呈卵圓形或圓形，陽性細(xì)胞胞漿染色較深，多為星形膠質(zhì)細(xì)胞。以正常羊血清代替CPG15一抗孵育對照組的切片，結(jié)果為陰性，見圖1。從各組照片可以看出正常組大鼠海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色極淺，量少，而其余四組大鼠海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色明顯變深，量多，其中以電針經(jīng)穴組與西藥治療組CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色最為顯著，而電針非經(jīng)穴組大鼠海馬區(qū)CPG15陽性細(xì)胞胞漿染色相對較淺，與模型組差異不明顯。

圖1 免疫組化方法檢測各組大鼠缺血再灌注海馬區(qū)CPG15蛋白表達(dá)情況

3.3 免疫組織化學(xué)方法檢測海馬組織CPG15 見表2。由表2可以看出正常組CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)不顯著，平均光密度值低，較其他各組均有顯著性差異，P＜0.01;其他各組CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)及平均光密度值均有提高，且電針經(jīng)穴組與尼莫地平組表達(dá)最明顯，此兩組之間比較差異性不顯著，P＞0.05，但較模型組和電針非經(jīng)穴組有顯著性差異，P＜0.01，而模型組與電針非經(jīng)穴組CPG15陽性細(xì)胞表達(dá)及平均光密度值比較，差異性不大，P＞0.05。說明電針和西藥尼莫地平對于增強(qiáng)CPG15的表達(dá)起到明顯促進(jìn)作用。

表2 各組缺血2h再灌注CPG15表達(dá)陽性細(xì)胞單位面積和平均光密度值治療后對比

4 討論

CPG15是以色列科學(xué)家Nedivi等于1993年通過構(gòu)建谷氨酸類似物海人藻酸(KA，kainic acid)激活型大鼠海馬齒狀回 cDNA文庫得到的一個基因［4］。1996年，Nedivi［5］從KA激活型大鼠海馬齒狀回cDNA文庫和人類皮質(zhì)cDNA文庫篩選、鑒定得到CPG15，并進(jìn)行了初步的功能研究發(fā)現(xiàn)CPG15能促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長，故又將其命名為Neuritin。CPG15是一個在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的基因［6］，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中主要在海馬、嗅球中表達(dá);而在成年后，表達(dá)限制在那些發(fā)生結(jié)構(gòu)改變并與神經(jīng)活動密切相關(guān)的組織［7］。CPG15蛋白能促進(jìn)神經(jīng)突起的生長及其分支和突觸的發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形成;其表達(dá)主要局限于神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)可塑性相關(guān)的區(qū)域，且神經(jīng)活動和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophines，NTs)均能誘導(dǎo)其表達(dá)，提示CPG15可能與神經(jīng)活動及NTs促進(jìn)神經(jīng)突起生長的作用有關(guān)［8］。這些特點使CPG15成為神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟及創(chuàng)傷修復(fù)中重要候選因子。CPG15在促進(jìn)突觸成熟、防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)元等方面有重要作用［9］。并且介導(dǎo)神經(jīng)生長因子(NGF)促進(jìn)成人感覺神經(jīng)元軸突的生長［10］。

神經(jīng)細(xì)胞之間通過特異的通訊結(jié)構(gòu)——“突觸”形成功能性神經(jīng)環(huán)路來傳遞和存儲信息。突觸在神經(jīng)細(xì)胞持續(xù)活動影響下可發(fā)生特異性的結(jié)構(gòu)和功能變化，這稱之為“突觸可塑性”。它在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶中起著至關(guān)重要的作用。電針治療腦梗塞的生物學(xué)基礎(chǔ)是通過多種機(jī)制影響神經(jīng)元可塑性，目前關(guān)于針灸對腦神經(jīng)可塑性研究已見部分報道，盧圣鋒等［11］以SAMP8小鼠作為老年癡呆(AD)動物模型，電針“百會”、“涌泉”穴，發(fā)現(xiàn)電針能有效調(diào)整海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)，使突觸后致密物增厚，突觸間隙寬度變窄，促進(jìn)突觸形態(tài)可塑性的發(fā)揮。徐虹等［12］觀察到，電針能夠抑制損傷相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞信號表達(dá)，促進(jìn)修復(fù)相關(guān)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，認(rèn)為針刺可能通過上調(diào)損傷－修復(fù)網(wǎng)絡(luò)功能，促進(jìn)梗死區(qū)神經(jīng)功能的恢復(fù)。高劍鋒等［13］研究發(fā)現(xiàn)局灶腦缺血再灌注可激活老齡大鼠海馬角回(dentate gyrus，DG)區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，針刺穴位能使局灶腦缺血再灌注后海馬DG區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生明顯增殖，有效提高神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元分化，合理調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，從而發(fā)揮拮抗腦缺血再灌注損傷作用。趙丹等［14］研究多巴胺D1、D2受體在腦缺血后神經(jīng)可塑性中的作用及電針的影響，發(fā)現(xiàn)電針可以對腦缺血后多巴胺D1、D2受體的數(shù)量和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，減輕其損害作用，促進(jìn)其達(dá)到平衡狀態(tài)，從而對神經(jīng)功能進(jìn)行保護(hù)和修復(fù)。

我們的實驗結(jié)果提示針刺對促進(jìn)大鼠缺血再灌注損傷區(qū)CPG15陽性細(xì)胞含量的表達(dá)起到顯著促進(jìn)作用，同時神經(jīng)功能得到明顯改善，說明針刺對腦神經(jīng)可塑性具有促進(jìn)意義。據(jù)此我們認(rèn)為針灸治療腦梗塞，促進(jìn)腦神經(jīng)可塑性的機(jī)制可能是通過上調(diào)CPG15而發(fā)揮作用。CPG15基因參與了腦缺血損傷后神經(jīng)再生的調(diào)控。

百會、風(fēng)府均為督脈經(jīng)穴，督脈又歸屬于腦。此外，根據(jù)《靈樞·衛(wèi)氣》中“氣街”理論，“頭氣有街”、“氣在頭者，止之于腦”，即經(jīng)氣到頭部的都聯(lián)系于腦。又根據(jù)“四?！崩碚?，“腦為髓?！?，楊上善注說“胃流津液滲入骨空，變而為髓，頭中最多，故為海也，是腎所生，其氣上輸腦蓋百會穴，下輸風(fēng)府也”?？梢?，百會穴、風(fēng)府穴與腦密切聯(lián)系，是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴。針刺百會、風(fēng)府穴，具有醒腦開竅、健腦補(bǔ)髓、疏風(fēng)通絡(luò)的功效，因此選取此二穴作為電針治療腦缺血再灌注損傷模型的處理穴位。本次實驗證實了針刺“百會”、“風(fēng)府”可以促進(jìn)大鼠受損神經(jīng)功能恢復(fù)，能提高大鼠海馬區(qū)CPG15表達(dá)，說明電針對腦缺血再灌注后腦細(xì)胞的神經(jīng)可塑性有促進(jìn)作用。這為臨床針灸治療腦梗塞提供了理論依據(jù)。

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