馬興群 宋 勇

淋巴結轉移是惡性腫瘤進展的標志之一，越來越多的證據(jù)認為腫瘤新生淋巴管形成和淋巴結轉移之間有密切關系。了解調節(jié)淋巴結轉移和淋巴管生成的信號通路，有可能成為抑制腫瘤生長的新方法。近年來，陸續(xù)有報道認為血管內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)有抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴結轉移的作用，但其機制尚未完全明確?，F(xiàn)將相關研究進展作一綜述。

一、腫瘤新生淋巴管形成和淋巴結轉移在腫瘤研究中被忽視的原因

腫瘤細胞發(fā)生轉移是多數(shù)腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤細胞發(fā)生轉移的機制很多，包括腫瘤細胞侵犯局部組織、淋巴道轉移、血行播散等。長期的臨床和病理學觀察發(fā)現(xiàn)，淋巴管道轉移是腫瘤細胞發(fā)生播散的主要途徑［1］。伴有多發(fā)性淋巴結轉移的口腔鱗狀細胞癌(squamous cell carcinomas，SCCs)患者，5年生存時間與無淋巴結轉移患者比較，分別是26%和75%［2］。新生淋巴管形成常在胚胎期、組織損傷、炎癥、寄生蟲感染、腫瘤等情況下發(fā)生［3］。過去10年中對腫瘤新生血管形成的分子機制有了深入的研究，而對淋巴管形成和轉移在腫瘤中的重要作用一直被忽視，其原因之一可能是缺乏特異性分子標志物來區(qū)分血管內(nèi)皮細胞和淋巴管內(nèi)皮細胞，其次，對調節(jié)淋巴管生長的特異性生長因子也缺乏了解［1，4］。

二、淋巴管結構以及晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)表面的細胞因子及受體

淋巴管尾端是個盲端結構，表面被覆單層內(nèi)皮細胞，細胞之間有不規(guī)則間隙，孔隙較大，細胞間連接和緊密連接稀疏分布。毛細血管被覆雙層內(nèi)皮細胞，細胞間密布緊密連接，循環(huán)周細胞豐富，而起始淋巴管的周細胞分布較少或者缺如，細胞膜不完整，細胞骨架借助彈性蛋白絲與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)相連［5］。透明質酸(hyaluronan，HA)是ECM的主要成分之一，HA與白細胞以及腫瘤細胞表面的CD44跨膜受體相互作用，為白細胞遷移和腫瘤細胞向遠處淋巴結轉移提供通道［6］。在LECs表面有特異性分子標志物:淋巴管內(nèi)皮透明質酸受體抗體LYVE-1(lymphatic vessel endothelial HA receptor)，調控早期淋巴管生成的同源基因Prox-1及腎小球足突細胞膜粘蛋白受體podoplanin［3-4］。LYVE-1是最近發(fā)現(xiàn)的HA受體，僅在LECs上有高度表達，參與淋巴細胞歸巢和腫瘤細胞遷移。分子結構與CD44高度相似，但是CD44分子在LECs幾乎沒有表達，因LYVE-1與CD44功能相似，能與可溶性和不可溶性的HA結合，用免疫電子顯微鏡檢查，LYVE-1的管腔結構具有淋巴管的超微結構特征，LYVE-1是目前罕為人知的淋巴管特異性分子標志物之一［6］。此外，在LECs表面有VEGF-C的表達，該因子是VEGF家族中的成員之一，能激活VEGFR-3［4］。開放的細胞連接和淋巴微孔是腫瘤細胞入侵的門戶，腫瘤細胞可誘導新生淋巴管生成。既往認為只有在腫瘤原發(fā)部位和癌旁會有新生淋巴管形成，即腫瘤誘導新生淋巴管(tumoral lymphangiogenesis)形成。腫瘤細胞是以滲透或者栓子形式，通過體內(nèi)已經(jīng)存在的成熟淋巴管達到前哨淋巴結并發(fā)生遠處轉移，而并不是通過新生淋巴管道轉移的。近年發(fā)現(xiàn)在區(qū)域淋巴結尤其是被腫瘤細胞侵犯的前哨淋巴結附近也有新生淋巴管形成，這一現(xiàn)象被稱為淋巴結誘導淋巴管形成(lymph node lymphangiogenesis)。這些淋巴管不斷生長并為各級淋巴結轉移提供額外通道，新生淋巴管生成和淋巴結轉移相輔相成，促進腫瘤細胞轉移［7］。類似于血管生成調節(jié)方式，淋巴管生成也受到淋巴管生成因子以及淋巴管生成抑制因子的精細調控。LECs表面有多種細胞因子及受體的表達，1996年Eola等［8］發(fā)現(xiàn)VEGF-C與VEGFR-3結合，可能在淋巴管生成過程中起到調節(jié)作用。越來越多的實驗證明，VEGF-C是調節(jié)淋巴管生成以及淋巴結轉移的主要因子［1，4，9］。腫瘤細胞能誘導VEGF-C高表達，促進淋巴管生成以及淋巴結轉移［1，4］。過表達VEGF-C的轉基因小鼠，對腫瘤原發(fā)灶增值的作用不明顯，但是卻顯著地增加前哨淋巴結附近的淋巴管增生，而野生型小鼠，不能誘導LECs從主靜脈發(fā)出以及淋巴管形成［3，4］。因此，抑制VEGF-C表達有可能達到抑制癌細胞經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉移，進而為輔助抗腫瘤治療提供新的治療方法。

三、ES抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴結轉移的經(jīng)典分子機制

1997年O’Relly在鼠血管瘤細胞株的培養(yǎng)上清中分離得到的一種血管生成抑制因子，它可以抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，并誘導內(nèi)皮細胞凋亡，測序發(fā)現(xiàn)它是源于ⅩⅤⅢ膠原蛋白C-末端的水解片段，是以膠原蛋白ⅩⅤⅢ為前體切割而來，并命名為ES［10］。ES在多種腫瘤動物模型中能抑制腫瘤生長和血管生成，未出現(xiàn)毒性及耐藥性［11-12］。近年發(fā)現(xiàn)ES和淋巴結轉移以及淋巴管生成之間有密切聯(lián)系。Nikolaos等對315例1991年2月至1999年7月之間的SCCs原發(fā)病灶和轉移性淋巴結的石蠟標本進行免疫組化，多發(fā)淋巴結轉移(N+)的SCCs原發(fā)病灶缺乏角化和淋巴細胞浸潤，細胞核呈高度多形性，淋巴結轉移附近有絲分裂相明顯增加，ES蛋白和ⅩⅤⅢ膠原蛋白的表達較無淋巴結轉移者明顯下調，ES蛋白在原發(fā)病灶和多發(fā)淋巴結轉移之間的表達無明顯差異。無淋巴結轉移的SCCs患者3年和5年生存期明顯延長，表皮角化程度較高［2］。這一研究結果提示ES可能有抑制淋巴結轉移和新生淋巴管生成作用，并能改善SCCs的分化，提高角質化程度。高表達ES的J4轉基因小鼠，與野生型小鼠相比，血清中ES含量高1.6倍，能明顯改善化學致癌物誘導的皮膚癌分化，降低腫瘤惡性度和侵襲力。皮膚鱗狀細胞癌和良性乳頭狀瘤小鼠，在各不同時間點，LYVE-1+淋巴管密度都明顯降低，淋巴結轉移率顯著下降。第34周的乳頭狀瘤小鼠，VEGF-C的表達較對照組下降7倍，VEGFR-3含量下降15倍，而VEGF-A、VEGF-D、VEGFR-2的含量在兩組中無差異。研究進一步發(fā)現(xiàn)，被癌細胞侵入的肥大細胞能高表達VEGF-C，而這種細胞在同一分化級別的高表達ES的J4小鼠中分布很少。肥大細胞主要參與腫瘤細胞的粘附和遷移過程，ES能特異性的抑制肥大細胞的這一過程，使VEGF-C的表達下調，進而抑制新生淋巴管生成，減少淋巴結轉移［13］。Shunsuke等［14］發(fā)現(xiàn)含有ES基因的腺病毒(Ad-end)轉染裸鼠后，Ad-end體外能抑制臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和微管形成，體內(nèi)能抑制口腔原位移植瘤生長，與對照組相比，第23天，腫瘤體積被抑制2/3，淋巴管密度分別是(1.6 ± 1.1)個和(5.4 ± 1.3)個，淋巴結轉移數(shù)量分別是(0，5/5)和(100%，5/5)，同時腫大淋巴結數(shù)量明顯減少.免疫組化及蛋白印跡發(fā)現(xiàn)VEGF-C表達明顯降低。Dong等［15］在實驗中發(fā)現(xiàn)，Lewis肺癌小鼠隨機分成2組分別給予恩度和生理鹽水處理 ，治療組腫瘤體積和轉移瘤數(shù)量明顯減小，淋巴管密度明顯降低。發(fā)生轉移的淋巴結數(shù)量明顯減少，VEGF-C的表達明顯下調(P＜0.001)。賈漪濤等［16］對宮頸癌移植瘤裸鼠進行實驗發(fā)現(xiàn)，恩度可以通過抑制裸鼠宮頸癌模型的血管和淋巴管生成，而抑制腫瘤的生長和淋巴結轉移。大劑量恩度(20 mk/kg)+順鉑組、小劑量恩度(10 mg/kg)+順鉑組和恩度組(10 mk/kg)的腫瘤生長速度明顯慢于對照組和順鉑組(P＜0.05)。

四、ES抑制淋巴結轉移和腫瘤新生淋巴管生成的其他機制

近年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)ES通過其他分子機制抑制淋巴管形成和淋巴結轉移。ES的主要靶細胞是內(nèi)皮細胞，ES是否會直接損傷內(nèi)皮細胞進而抑制新生淋巴管形成?Yan等發(fā)現(xiàn)LECs表面有一種特異性受體——核仁素(nucleolin)，該受體選擇性表達在新生淋巴管LECs上，而在成熟淋巴管LECs表面無表達，ES能直接抑制LECs遷移、微管形成以及ERK信號通路的激活等，對正常淋巴管無影響，而中和細胞表面的核仁素或者將核仁素基因敲除后，ES的上述作用消失。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，PBS處理組的B16/F10黑色素瘤小鼠，廣泛出現(xiàn)腋下和腹股溝淋巴結轉移，ES處理組則淋巴結轉移數(shù)明顯降低，而ES聯(lián)合抗核仁素抗體組則同樣出現(xiàn)腋下和腹股溝淋巴結轉移，即ES的存在不能翻轉抗核仁素抗體的抑制效應，兩組淋巴管podoplanin染色和LYVE-1都出現(xiàn)陽性，同時核仁素在兩組新生淋巴管上都有高表達，而在正常小鼠LYVE-1陽性的皮膚、結直腸和淋巴結等處都未見有核仁素表達。乳腺癌小鼠模型中，腋下和腹股溝淋巴結轉移現(xiàn)象在抗核仁素抗體組和ES聯(lián)合抗核仁素抗體組之間無明顯差別;而在乳腺癌肝臟轉移實驗模型中，抗核仁素抗體能抵消ES抑制肝臟微轉移灶形成的效應。上述實驗模型提示ES可能是在LECs表面的核仁素受體介導下抑制新生淋巴管形成，并抑制淋巴結轉移［16］。

纖維連接蛋白選擇性胞外區(qū)域A(extra domain A，EDA)是結腸癌細胞分泌的促淋巴管形成因子。整合素a9(integrin a9)也是淋巴管形成調節(jié)因子之一，可與VEGF-C/D結合，激活VEGF信號傳導通路。Hou等在結腸癌SW480小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，EDA是integrin a9的配體，二者形成復合物，共同定位於LECs表面，促進結腸癌新生淋巴管的形成。ES顯著抑制EDA-integrin a9復合物在LECs上表達，ES 20ng/ml處理后該復合物表達出現(xiàn)明顯的下降趨勢，ES 40ng/ml時該復合物的表達即消失。近一步研究發(fā)現(xiàn)，ES能導致LECs細胞骨架結構破壞、極性改變和重排，抑制淋巴微管結構形成［17］。

五、ES抑制淋巴結轉移和淋巴管生成的臨床應用

惡性胸腔積液產(chǎn)生的原因，歸納起來可以包括兩點:①腫瘤新生血管的生成，增加了毛細血管網(wǎng)的滲透面積，兩者共同作用引起血管滲透性增加;②腫瘤細胞阻塞了淋巴管，增加了淋巴液流體靜壓，使淋巴回流受阻，因而水和蛋白質吸收減少，潴留于漿膜腔內(nèi)［18］。Jiang等［19］在實驗發(fā)現(xiàn)，重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度)經(jīng)腹腔內(nèi)注射治療小鼠腹腔積液，能明顯地降低小鼠腹膜的滲透性，顯著減少實驗小鼠腹水中VEGF水平，其中以恩度8 mg/kg和16 mg/kg劑量腔內(nèi)注射治療腹水效果最佳。Fang等［20］在Ad-end轉染實驗小鼠胸腔積液模型中發(fā)現(xiàn)，ES能抑制胸膜新生血管形成、降低胸膜血管通透性，抑制胸腔積液和胸膜轉移性結節(jié)形成等作用。ES能治療漿膜腔積液，除考慮與降低血管通透性，抑制積液形成有關外，可能與抑制淋巴結轉移，通暢淋巴引流，促進積液排泄等過程中有重要關系。即一方面降低新生血管通透性，減少積液形成，另一方面減少腫瘤細胞發(fā)生淋巴結轉移，減少淋巴管阻塞，通暢引流，在來源和去路兩個方向產(chǎn)生作用。當然，上述實驗未對胸膜或者腹膜進行淋巴管染色和HE染色，，淋巴管的管腔結構是否發(fā)生相應變化，淋巴結轉移率是否下降等有待于后續(xù)實驗進一步證實。

上述研究提示ES主要通過下調VEGF-C的表達，抑制淋巴管生成和淋巴結轉移。這一通路被認為是經(jīng)典途徑。目前ES抑制腫瘤新生淋巴管生成和淋巴結轉移的研究主要集中在鱗狀細胞癌和肺癌等腫瘤模型中，原因可能是在這類腫瘤中，腫瘤細胞經(jīng)淋巴結轉移比血行播散更重要，而傳統(tǒng)的手術、放化療等方法尚不能達到完全抑制腫瘤轉移的目的。除了下調細胞因子外，ES還直接作用于LECs表面的相關受體，抑制新生淋巴管形成和淋巴結轉移。淋巴管形成和淋巴結轉移之間有相輔相成的作用，促進腫瘤細胞轉移。ES能抑制淋巴管生成和淋巴結轉移，無疑對“抗血管生成治療腫瘤”這一傳統(tǒng)方案是錦上添花，未來我們努力的方向，應該是加強ES抑制腫瘤形成和轉移機制的更深入了解，構建合理的基因治療載體，以及聯(lián)合放、化療等多種治療方案上，更好的提高腫瘤患者的生活質量。

1 Stefano J Mandriota，Lotta Jussila ，Michanel Jeltsch，et al.Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promote tumor metastasis［J］.EMBO J，2001，20(4):672-682.

2 Nikolaos G Nikitakis，Helen Rivera，Marcio A Lopes，et al.Immunohistochemical expression of angiogenesis-related markers in oral squamous cell carcinomas with multiple metastatic lymph nodes［J］.Am J Clin Pathol，2003，119(4):574-586.

3 Nathanson SD.Insights into the mechanisms of lymph node metastasis［J］.Cancer，2003，98(2):413-423.

4 Satoshi Hirakawa，Lawrence FB，Shohta Kodama，et al.VEGF-C induced lymphangiogenesis in sentinel lymph nodes promotes tumor metastasis to distant sites［J］.Blood，2007，109(3):1010-1017.

5 Rui-Cheng JI.Lymphatic endothelial cells，lymphangiogenesis，and extracellular matrix［J］.Lymph Res Biol，2006，4(2):83-100.

6 David G Jackson，Remko Prevo，Steven Clasper，et al.LYVE-1，the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis［J］.Trends Immun，2001，22(6):317-321.

7 Masayuki Nagahashi，Subramaniam Ramachandran，Omar M Rashid，et al.Lymphangiogenesis:a new player in cancer progression［J］.World J Gastroenterol，2010 ，16(32):4003-4012.

8 Eola Kukk，Athina Lymboussaki，Suvi Taira，et al.VEGF-C receptor binding and pattern of expression with VEGFR-3 suggests a role in lymphatic vascular development［J］.Development，1996，122(12):3829-3837.

9 Marika J Karkkainen，Paula Haiko，Kirsi Sainio，et al.Vascular endothelial growth factor C is required for sprouting of the first lymphatic vessels from embryonic veins［J］.Nature Immun，2004，5(1):74-80.

10 Michael S O’Reilly，Thomas Boehm，Yuen Shing，et al.Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth［J］.Cell，1997，88(2):277-285.

11 Judah Folkman.Antiangiogenesis in cancer therapy-endostatin and its mechanisms of action［J］.Exp Cell Res，2006，312(5):594-607.

12 Thomas Boehm，Judah Folkman，Timothy Browder，et al.Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance［J］.Nature，1997，390(27):404-407.

13 Ga?lle Brideau，Markus J M?kinen，Harri Elamaa，et al.Endostatin overexpression inhibits lymphangiogenesis and lymph node metastasis in mice［J］.Cancer Res，2007，67(24):11528-11535.

14 Shunsuke Fukumoto，Masayo Morifuji，Yoshinori Katakura，et al.Endostatin inhibits lymph node metastasis by a down-regulation of the vascular endothelial growth factor C expression in tumor cells［J］.Clin Exp Metastasis，2005，22(1):31-38.

15 Dong X，Zhao X，Xiao T，et al.Endostar，a recombined humanized endostatin，inhibits lymphangiogenesis and lymphatic metastasis of Lewis lung carcinoma xenograft in mice［J］.Thorac Cardiov Surg，2011，59(3):133-136.

16 賈漪濤，李中信，劉 敏，等.重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液對宮頸癌裸鼠移植瘤生長轉移及血管淋巴管生成的抑制作用［J］.中華腫瘤雜志，2009，4(4):3753-3766.JIA Yi-tao，LI Zhong-xin，LIU Min，et al.Endostar reduces the growth and metastasis by inhibiting angiogenesis and lymphangiogenesis in nude mouse models of human cervical cancer［J］.Chin J Oncol，2009，4(4):3753-3766.

17 ZHUO Wei，LUO Chong，WANG Xiao-feng，et al.Endostatin inhibits tumour lymphangiogenesis and lymphatic metastasis via cell surface nucleolin on lymphangiogenic endothelial cells［J］.J Pathol，2010，222(3):249-260.

18 Juanjuan Ou，Jianjun Li，F(xiàn)eng Pan，et al.Endostatin suppresses colorectal tumor-induced lymphangiogenesis by inhibiting expression of fibronectin extra domain A and integrin a9［J］.J Cellul Biochem，2011，112(8):2106-2114.

19 姜子瑜，秦叔逵.重組人血管內(nèi)皮抑素治療惡性漿膜腔積液的研究進展［J］.臨床腫瘤學雜志，2010，15(10):937-943.JIANG Zi-yu，QIN Shu-kui.Study progression of recombinant human endostatin(endostar)for the treatment of malignant cavity effusion［J］.Chin Clin Oncol，2010，15(10):937-943.

20 Fang Fang，Ping Chen，Xin Wu，et al.Therapeutic effects of recombinant human endostatin adenovirus in a mouse model of malignant pleural effusion［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135(9):1149-1157.